多硫化物對(duì)大腸桿菌OxyR regulon活性狀態(tài)的影響.pdf

1、H2S作為第三種氣體信號(hào)分子的假說由來已久，H2S的生理作用表現(xiàn)為兩重性，一方面，H2S能抑制細(xì)胞色素氧化酶的活性[1]，影響電子傳遞鏈上的電子傳遞，抑制生物呼吸;另一方面，適量的H2S又對(duì)生物體的心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面有重要功能[2]?，F(xiàn)有研究表明，H2S的信號(hào)作用與靶向蛋白的硫巰基化（-SSH）修飾有關(guān)。但是這一修飾仍然存在爭(zhēng)議，也有研究者認(rèn)為H2S是通過硫烷(S0，sulfane sulfur)對(duì)蛋白進(jìn)行了

2、-SSH的修飾。
　　H2S作用的兩重性還表現(xiàn)在其與活性氧自由基(ROS)的關(guān)系上。有研究表明，H2S的積累可以使生物體內(nèi)ROS提高;但也有文章證明，敲除大腸桿菌中主要的負(fù)責(zé)產(chǎn)生H2S的基因3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)移酶（sseA），會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)抗生素（通過氧化壓力升高造成細(xì)菌死亡的抗生素類型）的抗性降低?？梢?，H2S與生物體內(nèi)的ROS息息相關(guān)，
　　本論文以大腸桿菌為載體，構(gòu)建了一系列不同H2S產(chǎn)量的菌株，在此基礎(chǔ)上對(duì)H2S與氧

3、化應(yīng)激之間的關(guān)系作了相應(yīng)的研究。通過survival test、抑菌圈的測(cè)定等實(shí)驗(yàn)，證實(shí)H2S在改變菌體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)及應(yīng)對(duì)外界氧化壓力方面都有相應(yīng)功能。選取了大腸桿菌主要應(yīng)激系統(tǒng)—ArcAB系統(tǒng)、SoxRS調(diào)控系統(tǒng)及OxyR調(diào)節(jié)子進(jìn)行研究，結(jié)果表明，多硫化物(polysulfides)可以使OxyR的活性狀態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而影響菌體內(nèi)若干基因的表達(dá)。
　　本論文首次提出OxyR除了受H2O2誘導(dǎo)外，還受到polysulfides

4、的調(diào)控。論文選取已有文獻(xiàn)報(bào)道的受OxyR調(diào)控的四個(gè)基因katG、dps、grxA、trxC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用PCR的方法擴(kuò)增這些基因的啟動(dòng)子區(qū)，構(gòu)建含有egfp/mkate熒光基因的報(bào)告質(zhì)粒，利用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)大腸桿菌本底水平或經(jīng)質(zhì)粒過量表達(dá)的OxyR，通過熒光值的改變來判定OxyR的狀態(tài)變化。氧化態(tài)和還原態(tài)的OxyR雖然都能與DNA結(jié)合但只有氧化態(tài)OxyR才能激活下游基因的表達(dá)。利用H2O2和polysulfides作為誘導(dǎo)物進(jìn)行比較分析，我們

5、得出，在對(duì)OxyR的誘導(dǎo)方面，polysulfides所起作用與H2O2相似，不同在于，較低濃度的polysulfides就可以使OxyR產(chǎn)生構(gòu)象的改變，并且敲除oxyR基因，polysulfides對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用比H2O2更強(qiáng)烈。這說明，OxyR對(duì)polysulfides更為敏感。
　　通過對(duì)其反應(yīng)機(jī)理的分析，我們發(fā)現(xiàn)通過polysulfides處理的OxyR更易以四聚體的形式與DNA結(jié)合，說明polysulfides對(duì)O

6、xyR活性的調(diào)節(jié)可能是通過改變蛋白的聚合狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)的。本論文還對(duì)OxyR蛋白受誘導(dǎo)后的結(jié)構(gòu)改變做了分析，通過DTT、H2O2、polysulfides分別對(duì)純蛋白進(jìn)行了處理，并進(jìn)行了MALDI-TOF分析。結(jié)果表明，H2O2和polysulfides對(duì)蛋白的修飾是兩種不同的形式。并且無論何種處理，OxyR活性狀態(tài)時(shí)兩個(gè)活性位點(diǎn)的半胱氨酸之間都沒有二硫鍵的生成。除此之外，我們對(duì)OxyR氧化過后還原型狀態(tài)的恢復(fù)做了相應(yīng)研究，據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道g