結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC安全性初步評(píng)價(jià)與融合蛋白MAR和MRA的構(gòu)建.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)章節(jié)進(jìn)行探討：
　　第一章 結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC安全性初步評(píng)價(jià)
　　目的：對(duì)以陽(yáng)離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨（dimo-thylidioctyl ammoni-um bromide， DDA）、聚肌胞苷（ polyriboinosinic-polyribocytidylic acid， Poly I:C）與膽固醇（cholesterol）復(fù)合佐劑（簡(jiǎn)稱為DPC）為佐劑的結(jié)核融合蛋白 ESAT6-Ag

2、85B-MPT64(190-198)-MTB8.4-Rv2626c（LT70）亞單位疫苗的毒理學(xué)進(jìn)行研究，以初步評(píng)價(jià)其安全性。
　　方法：1.急性毒性試驗(yàn)，分別將LT70-DPC亞單位疫苗與佐劑DDA的低劑量與高劑量（分別相當(dāng)于人用劑量的10000倍和40000倍）經(jīng)皮下、腹腔兩種途徑1次給予小鼠，觀察毒性反應(yīng)和死亡情況等，同時(shí)推算小鼠對(duì)LT70-DPC亞單位疫苗的最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD

3、）。2.異常毒性試驗(yàn)，小鼠和豚鼠腹腔1次注射疫苗，觀察有無(wú)異常反應(yīng)、死亡情況及體重變化。3.全身過敏試驗(yàn)，豚鼠致敏后靜脈快速注射攻擊，觀察有無(wú)過敏反應(yīng)。
　　結(jié)果：1.急性毒性試驗(yàn)，將兩種濃度的疫苗經(jīng)皮下與腹腔兩種途徑注射小鼠后，均未引起小鼠的異常反應(yīng)和死亡，小鼠體重增加。小鼠對(duì)LT70-DPC亞單位疫苗的最大耐劑受量（MTD）為：LT70蛋白>6600μg/kg，DDA>166600μg/kg，PolyI:C>33200μg/k

4、g，膽固醇>50600μg/kg。2.異常毒性試驗(yàn)，腹腔注射7d后，小鼠與豚鼠全部健存，體重增加，且均未出現(xiàn)異常癥狀。3.全身過敏試驗(yàn)，疫苗組均未出現(xiàn)過敏反應(yīng)。
　　結(jié)論：急性毒性試驗(yàn)，異常毒性試驗(yàn)與全身過敏試驗(yàn)的結(jié)果顯示兩種濃度的疫苗均未檢測(cè)到毒副作用，表明LT70-DPC蛋白亞單位疫苗安全性好。
　　第二章 結(jié)核亞單位疫苗融合蛋白的構(gòu)建
　　目的：為使實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建的無(wú)標(biāo)簽的融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MP

5、T64(190-198)-MTB8.4-Rv2626c（LT70）更易純化，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化改造。同時(shí)為研究不同融合蛋白的表達(dá)與純化特性，本研究選用結(jié)核分枝桿菌早期分泌蛋白Ag85B和ESAT6家族成員MTB10.4，以及潛伏期抗原Rv1738，克隆構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽結(jié)核分枝桿菌融合蛋白 MTB10.4-Ag85B-Rv1738（ MAR）與 MTB10.4-Rv1738-Ag85B（MRA）。
　　方法：通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，對(duì)LT70蛋白中的Ag

6、85B基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將第83個(gè)氨基酸I-ATA異亮氨酸突變?yōu)闉镃GT-R精氨酸，第140個(gè)氨基酸亮氨酸L-TTG突變?yōu)锳AA-K賴氨酸，以減弱蛋白的疏水性。應(yīng)用分子克隆技術(shù)設(shè)計(jì)含有不同酶切位點(diǎn)的引物，以H37Rv-DNA為模板，PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，將抗原基因MTB10.4、Ag85B和Rv1738依次插入到表達(dá)載體pET-30a(+)的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET30a-MTB10.4-Ag85B-Rv1738與 pET3

7、0a-MTB10.4-Rv1738-Ag85B；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用疏水作用色譜層析（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）和離子交換色譜層析((Ion exchange chromat-ography，IEX)等技術(shù)進(jìn)行融合蛋白的純化。
　　結(jié)果：突變后的LT70蛋白相較之前，疏水性仍然較強(qiáng)，結(jié)合到疏水作用層析柱后不易洗脫。構(gòu)建的融合蛋

8、白MAR和MRA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的基因序列與 GenBank中完全一致，在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物分子量與預(yù)計(jì)相同，約53KD，二者分別以包涵體和上清表達(dá)為主，應(yīng)用離子交換色譜層析(IEX)和疏水作用色譜層析（HIC）等方法初步純化蛋白。
　　結(jié)論：此次對(duì)LT70蛋白的優(yōu)化改造并未很好的改善其疏水性，其改造方法有待進(jìn)一步研究。同時(shí)成功構(gòu)建了不帶標(biāo)簽的結(jié)核融合蛋MTB10.4-Ag85B-Rv1738（MAR）與MTB10.4-Rv173