融合蛋白亞單位疫苗對結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠和小鼠免疫治療效果的初步評價.pdf

1、背景：
　　由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的、主要經(jīng)呼吸道傳播的結(jié)核病(tuberculosis,TB)是目前世界范圍內(nèi)造成死亡人數(shù)最多的傳染病?？ń槊?Bacillus Calmette Guerin,BCG)的接種雖然能夠有效預防兒童TB的發(fā)生,但是無法防止成人的TB感染和潛伏感染的復發(fā)。由于對疫苗作用機制和MTB致病機制研究緩慢,使得研發(fā)比BCG更為安全有效的預防疫苗極

2、其困難。TB化療中使用的異煙肼(Isoniazid acid hydrazide,INH)、利福平(Rifampicin,RFP)等藥物主要針對生長活躍的MTB,對生長緩慢、代謝遲緩的MTB休眠菌的殺傷效果不明顯,而且化療存在治療周期長、毒副作用大、患者依從性較差等問題,加之TB耐藥形式的日益嚴峻,因此迫切需要研發(fā)新型的抗TB藥物和療法。治療性疫苗的接種可刺激機體產(chǎn)生特異性的抗MTB免疫應答,有助于提高免疫系統(tǒng)對持留菌的識別和清除,從而

3、縮短療程,是目前TB研究的重要方向之一。
　　目的：
　　建立MTB感染豚鼠模型,在此模型中評價融合蛋白Ag85B-ESAT-6+Hsp65-hIL-2組合 MPLA佐劑的亞單位疫苗單獨和聯(lián)合化療藥物的治療效果及抑制 MTB感染復發(fā)的能力;建立MTB感染小鼠模型,在此模型中評價上述亞單位疫苗的單獨治療和聯(lián)合化療藥物治療的效果。
　　實驗方法和結(jié)果：
　　一、融合蛋白Ag85B-ESAT-6的免疫學特性研究

4、　　方法:使用原核表達系統(tǒng)分別表達Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2,Ni2+離子親和層析法純化目的蛋白。以不同劑量(20μg、50μg、100μg、200μg、600μg) Ag85B-ESAT-6重組蛋白分別與50μg單磷酰脂質(zhì)A(MPLA)佐劑混合后皮下多點注射方式免疫豚鼠,共免疫3次,每次間隔3周。每次免疫后2周取血分離血清,ELISA法檢測免疫豚鼠血清特異性IgG抗體及IgG1和IgG2亞類滴度;末次免疫后2周處

5、死豚鼠,分離外周血白細胞,流式細胞術(shù)檢測外周血CD4+和CD8+T細胞比例。
　　結(jié)果:純化獲得了純化的重組融合蛋白Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2;以20μg Ag85B-ESAT-6免疫2次即可誘導豚鼠產(chǎn)生較高水平的IgG抗體;3次免疫后,豚鼠外周血CD4+和CD8+T細胞比例均有所下降。
　　二、融合蛋白亞單位疫苗對MTB感染豚鼠免疫治療效果的評價
　　方法:以105CFU MTB H37Rv經(jīng)腹

6、股溝皮下注射感染豚鼠,6周后平板計數(shù)法檢測感染豚鼠肺臟和脾臟荷菌量,確立模型建立。之后將感染豚鼠分為感染未治療組、免疫治療組、化療組、化療聯(lián)合免疫治療組;另設未感染豚鼠正常對照組?；熥愿腥竞蟮?周開始,采用INH和RFP聯(lián)用飲水治療,飲水中藥物濃度為108.5 mg/L INH、105 mg/L RFP,每周飲用5天,連續(xù)治療11周;免疫治療采用背部皮下接種,間隔一天給予10μg Ag85B-ESAT-6+10μg Hsp65-hIL

7、-2+5μg MPLA免疫兩次,3周后以同樣方法和劑量給予第二次免疫;全部治療結(jié)束后(即感染第17周)給予各組豚鼠腹腔注射地塞米松1mg/只,每周3次,持續(xù)4周,以此進行免疫抑制誘導感染復發(fā)。實驗過程中每周記錄豚鼠體重;分次采血并檢測血清特異性IgG抗體及IgG1和IgG2亞類水平;HE染色觀察肺組織病理變化;流式細胞術(shù)檢測外周血和脾臟CD4+和CD8+T細胞比例,總T和B細胞亞群比例;免疫治療完成后4周(感染后17周)和免疫抑制完成后

8、4周(感染后25周)處死豚鼠,平板計數(shù)法檢測肺臟和脾臟荷菌量。
　　結(jié)果:感染6周時豚鼠肺臟和脾臟出現(xiàn)肉眼可見的結(jié)核結(jié)節(jié),荷菌量分別為5.82±0.29 lgCFU和6.53±0.33 lgCFU,表明豚鼠感染模型建立成功。感染10周后,未治療組豚鼠體重停止增長,免疫治療組豚鼠在免疫抑制后體重下降明顯,至感染20周全部死亡;免疫治療組和化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠血清中抗MTB特異性IgG水平顯著高于感染未治療組(P<0.001,P<0

9、.001),且MTB特異性抗體的升高是以IgG2亞類為主;感染未治療組豚鼠肺組織呈現(xiàn)嚴重炎癥病變,而藥物治療組和化療聯(lián)合免疫治療組的豚鼠病理改變較輕;與感染未治療組相比,免疫治療和化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠外周血和脾臟T細胞水平呈上升趨勢,其中CD8+T細胞比例上升較明顯;治療結(jié)束后,免疫治療組、化療組和化療聯(lián)合免疫治療組肺臟荷菌量均顯著低于感染未治療組(P<0.05,P<0.05,P<0.01),化療組和化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠脾臟荷菌量顯

10、著低于感染未治療組(P<0.01,P<0.01),免疫抑制后,化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠肺臟荷菌量顯著低于化療組(P<0.05)。
　　三、融合蛋白亞單位疫苗對MTB感染小鼠免疫治療效果的評價
　　方法:以105 CFU MTB H37Rv尾靜脈注射感染C57BL/6J小鼠,4周后平板計數(shù)法檢測感染小鼠肺臟和脾臟荷菌量,確立模型建立。之后將小鼠分為感染未治療組、免疫治療組、半程化療組、半程化療聯(lián)合免疫治療組、全程化療組、全程化療

11、聯(lián)合免疫治療組;另設未感染小鼠正常對照組?；熥愿腥竞?周開始,采用INH和RFP聯(lián)用飲水治療(方法和劑量同上述豚鼠治療實驗),其中半程藥物治療時間持續(xù)4周,全程藥物治療持續(xù)11周;免疫治療采用背部皮下接種5μg Ag85B-ESAT-6+5μg Hsp65-hIL-2+5μg MPLA,在感染后第8周進行第一次免疫,3周后(感染后第11周)給予第二次免疫。治療結(jié)束后處死豚鼠分離脾淋巴細胞,流式細胞術(shù)檢測MTB抗原刺激后表達IFN-γ、

12、IL-2、IL-4和TNF-α四種細胞因子的CD4+和CD8+T脾淋巴細胞的比例;平板計數(shù)法檢測小鼠肺臟和脾臟荷菌量。
　　結(jié)果:感染4周時小鼠肺臟和脾臟荷菌量分別為3.67±0.10 lgCFU和3.54±0.14 lgCFU,表明小鼠感染模型建立成功。與正常對照組小鼠相比,感染未治療組和免疫治療組小鼠脾淋巴細胞在MTB抗原刺激培養(yǎng)后表達IFN-γ的CD4+T細胞比例顯著升高(P<0.001,P<0.001);感染未治療組和免疫

13、治療組表達IL-2的CD4+T細胞比例顯著高于正常對照組(P<0.01,P<0.01),半程化療聯(lián)合免疫治療組以及全程化療聯(lián)合免疫治療組該比例分別顯著高于相應的半程化療組和全程化療組(P<0.001,P<0.001);各感染組表達IL-4的CD4+ T細胞比例總體呈下降趨勢;全程化療聯(lián)合免疫治療組表達TNF-α的CD4+T細胞比例顯著低于全程化療組(P<0.001)。各組間表達IFN-γ的CD8+T細胞比例無顯著差異,感染未治療組和免疫

14、治療組表達IL-2的CD8+T細胞比例顯著升高(P<0.001,P<0.001);半程化療聯(lián)合免疫治療組和全程化療聯(lián)合免疫治療組該比例分別顯著高于半程化療組和全程化療組（P<0.001,P<0.01);感染未治療組和免疫治療組表達IL-4的CD8+T細胞比例均顯著上升,半程化療聯(lián)合免疫治療組該比例高于半程化療組(P<0.05);半程化療組和半程化療聯(lián)合免疫治療組停止化療后體內(nèi)荷菌量出現(xiàn)回升但相對緩慢,與感染未治療組和化療組相比,相應的免

15、疫治療組和化療聯(lián)用免疫治療組小鼠臟器荷菌量均無顯著差異。
　　結(jié)論
　　Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2組合MPLA佐劑的亞單位疫苗可有效刺激感染豚鼠產(chǎn)生抗MTB的特異性抗體,提高豚鼠外周血和脾臟T細胞比例,顯著降低感染豚鼠肺臟荷菌量,并且與化療聯(lián)合應用后可有效抑制治療后MTB感染復發(fā)。
　　該疫苗能夠拮抗MTB感染小鼠模型中化療所引起的分泌IL-2的CD4+和CD8+T細胞比例的降低,免疫治療聯(lián)合化療