結(jié)核潛伏抗原篩選與治療性融合蛋白疫苗的制備.pdf

1、目的：將潛伏期細菌表達的優(yōu)勢抗原與生長期細菌的優(yōu)勢抗原結(jié)合，有助于開發(fā)保護效果更好的新型結(jié)核亞單位疫苗。本試驗擬篩選免疫原性較強的結(jié)核分枝桿菌潛伏期抗原，制備含結(jié)核菌潛伏期抗原的新型治療性融合蛋白疫苗。進一步建立小鼠肺部卡介苗（BCG）潛伏感染模型，并用該模型對新構(gòu)建的融合蛋白疫苗的治療作用進行初步評價。
　　方法：
　　1)在大腸埃希菌中克隆表達前期利用生物信息學方法篩選出的HspX、Rv1738、Rv2626c、Rv20

2、07c和Rv3130c五個與結(jié)核潛伏感染相關(guān)抗原，檢測它們在結(jié)核病患者、密切接觸者和健康大學生志愿者中體液免疫和細胞免疫特征，評價上述抗原的免疫原性，篩選出免疫原性最強的抗原。
　　2)通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建融合蛋白pET30a-ESAT6-Rv1738-Rv2626c（LT40）和pET30a-CFP10-HspX（LT28），然后在大腸埃希菌中表達、得到相應(yīng)的蛋白。
　　3)在小鼠模型上檢測融合蛋白LT40的免疫原性，即

3、在第0、3、6周分別用蛋白LT40、ESAT6、Rv1738和Rv2626c免疫小鼠三次，末次免疫后6周檢測小鼠結(jié)核抗原的特異性抗體水平及脾細胞在結(jié)核抗原刺激下細胞因子IFN-γ的分泌情況。
　　4)用牛分枝桿菌減毒株卡介苗（BCG）5×106CFU通過滴鼻的方法造成小鼠肺部感染，感染后2天、4周、8周和12周行肺部結(jié)核菌落計數(shù)，并肌肉注射地塞米松以降低小鼠的免疫力，連續(xù)干預3周后隔一周進行菌落計數(shù)。地塞米松干預后檢測小鼠肺部BC

4、G的細菌載量，來確定潛伏感染模型是否建成。即當小鼠肺部組織培養(yǎng)不出分枝桿菌，但經(jīng)地塞米松免疫干預后，從肺臟組織中培養(yǎng)出了大量的分枝桿菌時，該模型成功建成。
　　5)利用建立的小鼠肺部BCG潛伏感染模型來評價融合蛋白疫苗的治療作用，使用的融合蛋白包括：ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)和LT40，我們實驗室已經(jīng)證實LT70對感染結(jié)核菌的小鼠具有較強的免疫保護力。小鼠感染BC

5、G后隨機分為五組：PBS組、佐劑組、LT40組、LT70組和LT40+LT70組。疫苗組小鼠分別于第12、14和16周用腹股溝皮下注射的方法進行疫苗治療干預，生理鹽水組和佐劑組小鼠同樣注射生理鹽水和佐劑作為對照。所有小鼠分別于第20、21和22周用肌肉注射地塞米松的方法進行免疫干預，在第25周用頸椎脫臼的方法處死小鼠，進行肺臟組織的分離與解剖和眼球取血，將肺臟組織研磨后進行BCG菌落計數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.人群試驗結(jié)果表

6、明，在5個結(jié)核菌潛伏期高表達的抗原HspX、Rv2626c、Rv2007c、Rv1738和Rv3130c中，在不同人群中抗原的免疫原性強弱依次是Rv1738、Rv2626c、Rv3130c、HspX和Rv2007c。這些抗原的免疫原性在結(jié)核病密切接觸者中均高于健康大學生志愿者和結(jié)核病患者。相反，在結(jié)核病患者人群中，結(jié)核生長早期分泌性抗原ESAT6和CFP10引起IFN-γ的分泌水平卻高于健康大學生志愿者。我們推測抗原Rv1738、Rv2

7、626c、Rv3130c在保護機體免受結(jié)核分枝桿菌侵害過程中起了不同程度的保護作用，其中在潛伏感染人群中，Rv1738抗原引起的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答最強，是結(jié)核菌潛伏期的一個保護性抗原。
　　2.串聯(lián)結(jié)核桿菌生長期抗原ESAT6、潛伏期抗原Rv1738和Rv2626c構(gòu)建融合蛋白疫苗LT40，發(fā)現(xiàn)其以包涵體的形式在大腸埃希菌中穩(wěn)定表達，得到較高純度的蛋白；連接結(jié)核桿菌生長期抗原CFP10和潛伏期抗原HspX構(gòu)建的融合蛋白LT28

8、在大腸埃希菌中表達量低，未純化出相應(yīng)蛋白。
　　3.小鼠免疫實驗表明：LT40蛋白可誘導LT40抗原免疫過的小鼠血清中產(chǎn)生特異性抗體IgG1和IgG2c，可刺激LT40抗原免疫過的小鼠脾淋巴細胞分泌較高水平的IFN-γ，而單個抗原刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)較弱，提示融合蛋白LT40誘導的免疫應(yīng)答與天然抗原有所不同。
　　4.成功建立小鼠肺部BCG潛伏感染模型。以滴鼻的方式使小鼠肺部感染BCG，12周后小鼠肺部組織培養(yǎng)不出分枝桿菌，但經(jīng)

9、地塞米松免疫干預后分枝桿菌大量暴發(fā)，從肺臟組織中培養(yǎng)出了大量的分枝桿菌。
　　5.利用建立的小鼠肺部BCG潛伏感染模型來評價蛋白疫苗的治療作用，結(jié)果示：相比其他組，PBS組結(jié)核菌載量較高，說明有大量的分枝桿菌在免疫抑制后暴發(fā)；相比 PBS組，疫苗治療組和佐劑組的結(jié)核菌載量均較低，而疫苗治療組（LT40組、LT70組和LT40+LT70組）的結(jié)核菌載量最低。說明LT40蛋白和LT70蛋白對小鼠肺部潛伏感染的BCG有一定的清除作用。<

10、br>　　結(jié)論：
　　1.在與結(jié)核潛伏感染相關(guān)的抗原（HspX、Rv2626c、Rv2007c、Rv1738和Rv3130c）中，Rv1738抗原引起的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答最強，是結(jié)核菌潛伏期的一個保護性抗原。
　　2.成功構(gòu)建融合蛋白疫苗LT40，其以包涵體的形式在大腸埃希菌中穩(wěn)定表達，得到較高純度的蛋白；LT40蛋白可誘導LT40抗原免疫過的小鼠血清中產(chǎn)生特異性抗體IgG1和IgG2c，可刺激LT40抗原免疫過的小鼠脾