結(jié)核抗原持續(xù)刺激致T細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)研究及亞單位疫苗LT70-DPC的研發(fā).pdf

1、本文對(duì)結(jié)核抗原持續(xù)刺激致T細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)研究及亞單位疫苗LT70-DPC的研發(fā)進(jìn)行了闡述。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一章：結(jié)核抗原持續(xù)刺激致T細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)核病是一種慢性感染性疾病，由結(jié)核分枝桿菌感染引起，是全球危害最為嚴(yán)重的傳染病之一。有研究報(bào)道嚴(yán)重的結(jié)核病患者CD4+T細(xì)胞，尤其是Th1細(xì)胞數(shù)目下降。我們也發(fā)現(xiàn)痰菌陽(yáng)性的纖維空洞型結(jié)核病患者對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原的T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力低于密切接觸者和結(jié)核病新發(fā)病人。以上現(xiàn)象都提

2、示嚴(yán)重的結(jié)核分枝桿菌感染可能造成機(jī)體免疫功能低下，其發(fā)生機(jī)制值得深入研究。
　　目的：通過(guò)結(jié)核抗原持續(xù)刺激建立T細(xì)胞耗竭小鼠模型，分析抗原持續(xù)刺激在結(jié)核病T細(xì)胞耗竭中的作用及可能的機(jī)制和治療措施。
　　方法：⑴采用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin。BCG）免疫C57BL/6小鼠，用結(jié)核亞單位蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c（簡(jiǎn)稱(chēng) LT70）聯(lián)合 M

3、tb10.4-HspX（簡(jiǎn)稱(chēng) MH）反復(fù)免疫10次，模擬結(jié)核分枝桿菌抗原持續(xù)刺激的狀態(tài)，建立T細(xì)胞耗竭模型。⑵通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析脾臟T細(xì)胞IFN-γ和IL-2的分泌水平；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD4+、CD8+ T細(xì)胞數(shù)目；通過(guò) TB10.44-12五聚體標(biāo)記檢測(cè)TB10.4特異性的記憶性CD8+ T細(xì)胞數(shù)目；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+/CD8+ T細(xì)胞表面程序性死亡受體1（Programmed Death1。PD

4、-1）的表達(dá)；通過(guò) BCG和銅綠假單胞菌攻擊，檢測(cè)不同模型組保護(hù)效果差異；進(jìn)一步檢測(cè) CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力。⑶在T細(xì)胞耗竭模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、IL-2和雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)治療，檢測(cè)以下指標(biāo)：抗原特異性細(xì)胞因子 IFN-γ和 IL-2的分泌水平；TB10.4特異性的記憶性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量；CD4+T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1的表達(dá)；BCG攻擊后的保護(hù)效果；CD34-L

5、in-Sca-1+c-Kit+造血干細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力。通過(guò)上述指標(biāo)檢測(cè)評(píng)價(jià)不同治療方案的治療效果。⑷在IL-2具有逆轉(zhuǎn) T細(xì)胞耗竭作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索 IL-2與造血干細(xì)胞增殖分化相關(guān)信號(hào)通路 JAK-STAT和PI3K之間的關(guān)系，揭示IL-2逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：①通過(guò)BCG免疫一次，結(jié)核亞單位疫苗 LT70和 MH加強(qiáng)免疫10次，成功建立T細(xì)胞耗竭模型。②相比于結(jié)核抗原短暫刺激（加強(qiáng)免疫2次）組。T細(xì)胞

6、耗竭組：細(xì)胞因子 IFN-γ和 IL-2的分泌水平顯著性降低（p<0.01）；CD4+、CD8+ T細(xì)胞數(shù)目顯著性減少（p<0.05）；TB10.44-12特異性的記憶性CD8+ T細(xì)胞數(shù)量顯著減少（p<0.05）；CD4+ T細(xì)胞表面抑制性受體 PD-1表達(dá)水平升高（p<0.05）；BCG和銅綠假單胞菌攻擊后清除率下降（p<0.05），機(jī)體抗感染保護(hù)能力明顯下降；CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細(xì)胞的數(shù)量降低，其增殖能

7、力被抑制（p<0.05）。③應(yīng)用造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、IL-2和雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)治療后，相比于 T細(xì)胞耗竭組，造血干細(xì)胞治療組和IL-2治療組具有逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭的作用：細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平顯著升高（p<0.05）；TB10.4特異性的記憶性 CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量增加（p<0.05）；CD4+ T細(xì)胞表面抑制性受體 PD-1表達(dá)水平下降（p<0.01）；BCG攻擊后，造血干細(xì)胞治療組和IL-2治療組的細(xì)菌載量顯著低

8、于T細(xì)胞耗竭未治療組；CD34-Lin-Sca-1+CD117+造血干細(xì)胞的增殖能力恢復(fù)（p<0.05）。④通過(guò)造血干細(xì)胞增殖分化相關(guān)通路 JAK-STAT和 PI3K研究發(fā)現(xiàn)，激酶3（Janus Kinase3。JAK3）蛋白主要在造血細(xì)胞中表達(dá)，T細(xì)胞耗竭組中骨髓造血干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子STAT-5磷酸化水平被抑制，IL-2治療后可以恢復(fù)STAT-5的磷酸化。
　　結(jié)論：應(yīng)用結(jié)核抗原持續(xù)刺激建立 T細(xì)胞耗竭動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，該模型從?/p>

9、個(gè)側(cè)面說(shuō)明大量細(xì)菌（抗原）刺激是結(jié)核分枝桿菌引起機(jī)體免疫功能低下的機(jī)制之一；T細(xì)胞耗竭后小鼠受特異性抗原刺激時(shí) IFN-γ等細(xì)胞因子分泌水平下降，CD4+和 CD8+T細(xì)胞數(shù)目和增殖能力下降，CD4+ T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1表達(dá)上調(diào)，造血干細(xì)胞分化為 T細(xì)胞的能力降低；應(yīng)用造血干細(xì)胞、IL-2治療后T細(xì)胞耗竭得以逆轉(zhuǎn)；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn) IL-2主要通過(guò)激活 JAK-STAT信號(hào)通路，使得轉(zhuǎn)錄因子 STAT-5磷酸化，調(diào)控造血干細(xì)胞

10、的增殖分化，從而恢復(fù)骨髓造血干細(xì)胞向T細(xì)胞分化的能力。
　　第二章：結(jié)核分枝桿菌融合蛋白LT70的構(gòu)建及其保護(hù)效果研究。結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌感染引起，是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時(shí)間最久、危害最為嚴(yán)重的傳染病之一。二十世紀(jì)八十年代以來(lái)，隨著耐藥菌株尤其是耐多藥結(jié)核菌及人類(lèi)免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus。HIV）的傳播與流行，結(jié)核病在世界各地的發(fā)病率呈現(xiàn)回升趨勢(shì)，發(fā)病率和死亡率高居不下?，F(xiàn)階段結(jié)核

11、病防治所使用的疫苗BCG是減毒牛分枝桿菌活疫苗。自1921年用于人類(lèi)接種，能夠有效預(yù)防新生兒和兒童患嚴(yán)重的腦膜結(jié)核及全身粟粒性結(jié)核病，但是不能有效預(yù)防成人肺結(jié)核的發(fā)生。因此，新型結(jié)核疫苗的研究開(kāi)發(fā)迫在眉睫。
　　目的：通過(guò)建立針對(duì)休眠菌在內(nèi)的不同生長(zhǎng)狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌有效的免疫應(yīng)答，提高亞單位疫苗的免疫保護(hù)效力。
　　方法：⑴選用結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期抗原 ESAT6、Ag85B、Mtb8.4、MPT64的190-198位的氨基

12、酸多肽和潛伏期保護(hù)性抗原Hrp1（Rv2626c），構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c（LT70）。⑵該融合蛋白在大腸埃希菌E. coli BL21菌株中進(jìn)行表達(dá)；通過(guò)條件優(yōu)化，使該蛋白可溶性表達(dá)；進(jìn)而利用疏水柱層析和分子篩層析方法對(duì)其進(jìn)行純化。⑶將純化產(chǎn)物與佐劑二甲基三十六烷基銨（dimo-thylidioctyl ammonium bromide。DDA）和聚肌胞苷酸（

13、polyinosinic-polycytidylic acid。PolyI:C）混合制備結(jié)核亞單位疫苗LT70，分別在小鼠模型和家兔模型評(píng)價(jià)亞單位疫苗 LT70免疫學(xué)效應(yīng)及保護(hù)效率，并進(jìn)行BCG初免后亞單位疫苗的強(qiáng)化免疫策略研究。
　　結(jié)果：①LT70融合蛋白在大腸埃希菌E. coli BL21中可溶性表達(dá)，應(yīng)用疏水柱 Butyl-FF層析和分子篩 G-75的純化方法成功將其分離純化。②在小鼠模型免疫學(xué)評(píng)價(jià)中，亞單位疫苗 LT70

14、誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原特異性 IFN-γ水平和抗體IgG1、IgG2c水平顯著高于 BCG組和 PBS組，具有較強(qiáng)的免疫原性。③疫苗免疫30周后進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌 H37Rv毒株氣霧攻擊，LT70疫苗顯示出較強(qiáng)的免疫保護(hù)力（5.4±0.38 Log10 CFU），其保護(hù)效果強(qiáng)于 BCG（6.01±0.33 Log10 CFU）和 PBS組（6.53±0.26 Log10 CFU）；BCG初免后亞單位疫苗 LT70具有加強(qiáng)BCG的免疫效果（5.62

15、±0.64 Log10 CFU）（p=0.26）。
　　結(jié)論：結(jié)核亞單位 LT70疫苗可誘導(dǎo)較強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；在小鼠模型中具有較好的清除和抑制結(jié)核分枝桿菌的作用，其保護(hù)效果強(qiáng)于BCG，有望成為結(jié)核病防治的有效候選疫苗。
　　第三章：結(jié)核亞單位疫苗DPC佐劑的研究及其應(yīng)用。新型結(jié)核亞單位疫苗需要佐劑輔助以誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。選擇適當(dāng)?shù)淖魟┎粌H提高免疫應(yīng)答的水平，也可以改變免疫應(yīng)答的類(lèi)型。疫苗靶向細(xì)胞內(nèi)病原體如

16、結(jié)核分枝桿菌，需要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括活化CD4 Th1型輔助T細(xì)胞和CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte。CTL）。然而，當(dāng)前在臨床上使用的佐劑只有鋁佐劑，該佐劑可促進(jìn)Th2型體液免疫應(yīng)答，無(wú)法引起Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，研發(fā)新的可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑對(duì)結(jié)核疫苗的發(fā)展至關(guān)重要。我們?cè)谇捌谘芯恐校躁?yáng)離子脂質(zhì)體DDA為基礎(chǔ)，聯(lián)合Toll樣受體3激動(dòng)劑PolyI:C能誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1型細(xì)胞免疫

17、應(yīng)答和較強(qiáng)的免疫保護(hù)效果。但是佐劑DDA-PolyI:C（簡(jiǎn)稱(chēng)DP）的穩(wěn)定性較差，易發(fā)生絮凝現(xiàn)象，無(wú)法滿(mǎn)足臨床疫苗的需要。
　　目的：我們?cè)谧魟〥P的基礎(chǔ)上，研究增強(qiáng)佐劑穩(wěn)定性的方法，以構(gòu)建更加穩(wěn)定和有效的新型免疫佐劑，利于后期的研發(fā)和生產(chǎn)。
　　方法：⑴以佐劑DP為基礎(chǔ)，聯(lián)合不同輔料，通過(guò)粒徑和zeta電位等指標(biāo)評(píng)價(jià)佐劑的理化性狀和穩(wěn)定性，從而篩選可增強(qiáng)佐劑DP穩(wěn)定性的輔料。⑵利用乳化-溶劑揮發(fā)法，將 DDA和 PolyI

18、:C聯(lián)合膽固醇制成陽(yáng)離子脂質(zhì)體佐劑DDA-PolyI:C-膽固醇（簡(jiǎn)稱(chēng) DPC），并與融合蛋白 LT70聯(lián)合構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗 LT70-DPC。⑶在C57BL/6小鼠模型上進(jìn)行 LT70-DPC疫苗的免疫學(xué)評(píng)價(jià)和保護(hù)效率評(píng)價(jià)：0，2，4周進(jìn)行LT70-DPC疫苗的免疫，末次免疫后6周進(jìn)行免疫指標(biāo)的檢測(cè)，30周后結(jié)核分枝桿菌 H37Rv菌株攻擊，攻擊10周后檢測(cè)保護(hù)效率。
　　結(jié)果：①使用膽固醇聯(lián)合DDA和PolyI:C構(gòu)建新型疫

19、苗佐劑DPC。②通過(guò)佐劑的理化性狀分析結(jié)果顯示新型佐劑DPC較佐劑DP粒徑由約500nm降至約400nm，大小均一；同時(shí)，隨著膽固醇的加入，佐劑DP的Zeta電位由23.48（±2.93）升高至41.22（±4.04），佐劑 DP的穩(wěn)定性得以明顯提升。③將佐劑DPC與融合蛋白LT70聯(lián)合，構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC。通過(guò)C57BL/6小鼠模型進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示 LT70-DPC疫苗和 LT70-DP疫苗均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗

20、原特異性 IFN-γ水平和抗體 IgG1、IgG2c水平，其水平顯著高于BCG組和 PBS組（p<0.05）。④在小鼠保護(hù)效率實(shí)驗(yàn)中，結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。LT70-DPC組肺部細(xì)菌載量（5.43±0.37 Log10 CFU）與疫苗LT70-DP組細(xì)菌載量（5.4±0.38 Log10 CFU）相當(dāng)，均低于BCG組（6.01±0.33 Log10 CFU）；同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv毒株攻擊后，疫苗 L