熱休克處理在嗜酸乳桿菌抗凍干脅迫中的應用及其作用機制研究.pdf

1、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La.）具有多種益生特性和良好的發(fā)酵性能，被廣泛應用于食品和藥品行業(yè)，是乳酸菌發(fā)酵劑的重要菌種之一。真空冷凍干燥是工業(yè)生產(chǎn)中制備直投式乳酸菌發(fā)酵劑的常用方法，但是在冷凍干燥過程中，乳酸菌會受到多種損傷，導致乳酸菌發(fā)酵制劑活力降低。因此，提高凍干嗜酸乳桿菌的存活率對制備高活性乳酸菌發(fā)酵劑、提高生產(chǎn)效益都具有重要意義。本文以嗜酸乳桿菌ATCC4356為研究對象，在冷凍干燥前進行

2、熱休克處理，優(yōu)化了熱休克條件、超聲提取菌體全蛋白條件，并利用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術比較熱休克處理組與未處理的對照組在冷凍干燥前后的嗜酸乳桿菌蛋白質差異表達圖譜，經(jīng)質譜鑒定差異蛋白，利用生物信息學對差異表達蛋白質進行功能分類和代謝途徑分析，從蛋白組學水平探討熱休克處理調控嗜酸乳桿菌的抗凍干脅迫機制。進一步通過熱休克

3、預處理結合凍干保護劑來提高嗜酸乳桿菌菌粉凍干存活率，獲得熱休克處理條件和保護劑的最佳組合為制備高活性乳酸菌發(fā)酵劑提供一個新思路。
　　本研究主要內容包括：⑴菌培養(yǎng)時期、熱休克處理溫度和時間是影響熱休克處理效果的重要因素。獲得嗜酸乳桿菌ATCC4356的凍干存活率最高的熱休克處理條件，即菌培養(yǎng)18h后，在45℃熱休克處理30min，再進行冷凍干燥，其凍干存活率較高，為47％，約為未經(jīng)熱休克處理的對照組的2倍。⑵對超聲波法提取細菌全蛋

4、白的功率和時間進行了優(yōu)化，得到提取蛋白量最高的超聲條件為：工作6s停6s，150w，5min。制備 P1(凍干前對照組）、P2（凍干前熱休克組）、P3（凍干后對照組）和 P4（凍干后熱休克組）四組不同條件下的嗜酸乳桿菌全蛋白樣品，采用基于 iTRAQ技術的蛋白質組學研究構建蛋白質差異表達圖譜，共鑒定出蛋白質1185種，比較不同組間樣品蛋白質，統(tǒng)計得到差異蛋白數(shù)量表明經(jīng)過熱休克處理后菌體的蛋白損失明顯減小，說明熱休克處理對菌體蛋白有保護作

5、用。經(jīng)過生物信息學分析，結果表明熱休克處理主要通過調節(jié)細菌細胞中脂類代謝、糖代謝、能量產(chǎn)生和轉換、轉錄和翻譯、應激蛋白、核糖體的結構及其生物合成相關的蛋白來提高嗜酸乳桿菌ATCC4356的抗凍干脅迫能力。⑶比較了12種不同的保護劑與熱休克處理結合對嗜酸乳桿菌的凍干保護效果，其中10種保護劑能進一步增加凍干菌體的存活率，以脫脂乳為凍干保護劑的菌體存活率最高，以葡萄糖為保護劑時，兩種凍干保護處理的正向疊加作用最明顯，菌的存活率從34.42%