小鼠雌性生殖干細胞的分離、建系及功能研究.pdf

1、生殖生物學的傳統(tǒng)觀點認為，雌性哺乳動物出生后生殖腺內(nèi)的生殖細胞不能增殖，隨著年齡的增加而逐步減少，最終全部消失而失去生育能力。然而，2004年Johnson等經(jīng)過測定小鼠不同天數(shù)未閉鎖卵泡數(shù)和閉鎖卵泡數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)兩者存在不吻合性，即卵泡閉鎖的發(fā)生率要高于未閉鎖卵泡數(shù)量的減少率，因此推測卵巢具有增殖活性。本研究通過定位新生和成年小鼠卵巢內(nèi)增殖的生殖細胞來尋找體內(nèi)存在生殖干細胞的證據(jù)，再利用生物信息學工具預測出生殖細胞標志蛋白MVH含有跨膜

2、結構域可以用于磁珠分選，然后用膠原酶和胰蛋白酶消化卵巢和MVH磁珠分選的方法相結合進行細胞的分離純化，最后將純化的細胞在與精原干細胞類似的培養(yǎng)條件下進行體外培養(yǎng)。在該培養(yǎng)條件下，我們成功的建立了細胞系，體外培養(yǎng)傳代達60代以上。隨后，我們通過RT-PCR、免疫熒光細胞化學、Cobra等方法從mRNA水平、蛋白水平、表觀遺傳學水平等多個層面上鑒定該細胞的生殖干細胞特征，并且通過細胞的異體卵巢移植使不育小鼠恢復生育能力，從而證實其生殖干細胞

3、的功能。經(jīng)過體外和體內(nèi)實驗的驗證，我們不僅確定了所分離得到的細胞為小鼠雌性生殖干細胞，而且證實所建立的小鼠雌性生殖干細胞系能夠在體外長期維持。隨后，我們又通過改善純化步驟和尋找新的標志物進一步提高了小鼠雌性生殖干細胞的分離純化效率，進而提高建立該細胞系的成功率。小鼠雌性生殖干細胞的發(fā)現(xiàn)和成功的體外培養(yǎng)建系打破了生殖生物學的傳統(tǒng)觀點，開辟了一個新的研究領域;在臨床上，對婦科疾病和不育癥的治療可能帶來新的突破;在醫(yī)療保健上，有可能用于研發(fā)延