小鼠雌性生殖干細(xì)胞的分離、建系及功能研究.pdf

1、生殖生物學(xué)的傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，雌性哺乳動(dòng)物出生后生殖腺內(nèi)的生殖細(xì)胞不能增殖，隨著年齡的增加而逐步減少，最終全部消失而失去生育能力。然而，2004年Johnson等經(jīng)過(guò)測(cè)定小鼠不同天數(shù)未閉鎖卵泡數(shù)和閉鎖卵泡數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者存在不吻合性，即卵泡閉鎖的發(fā)生率要高于未閉鎖卵泡數(shù)量的減少率，因此推測(cè)卵巢具有增殖活性。本研究通過(guò)定位新生和成年小鼠卵巢內(nèi)增殖的生殖細(xì)胞來(lái)尋找體內(nèi)存在生殖干細(xì)胞的證據(jù)，再利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)出生殖細(xì)胞標(biāo)志蛋白MVH含有跨膜

2、結(jié)構(gòu)域可以用于磁珠分選，然后用膠原酶和胰蛋白酶消化卵巢和MVH磁珠分選的方法相結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞的分離純化，最后將純化的細(xì)胞在與精原干細(xì)胞類(lèi)似的培養(yǎng)條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。在該培養(yǎng)條件下，我們成功的建立了細(xì)胞系，體外培養(yǎng)傳代達(dá)60代以上。隨后，我們通過(guò)RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、Cobra等方法從mRNA水平、蛋白水平、表觀遺傳學(xué)水平等多個(gè)層面上鑒定該細(xì)胞的生殖干細(xì)胞特征，并且通過(guò)細(xì)胞的異體卵巢移植使不育小鼠恢復(fù)生育能力，從而證實(shí)其生殖干細(xì)胞

3、的功能。經(jīng)過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，我們不僅確定了所分離得到的細(xì)胞為小鼠雌性生殖干細(xì)胞，而且證實(shí)所建立的小鼠雌性生殖干細(xì)胞系能夠在體外長(zhǎng)期維持。隨后，我們又通過(guò)改善純化步驟和尋找新的標(biāo)志物進(jìn)一步提高了小鼠雌性生殖干細(xì)胞的分離純化效率，進(jìn)而提高建立該細(xì)胞系的成功率。小鼠雌性生殖干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和成功的體外培養(yǎng)建系打破了生殖生物學(xué)的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，開(kāi)辟了一個(gè)新的研究領(lǐng)域;在臨床上，對(duì)婦科疾病和不育癥的治療可能帶來(lái)新的突破;在醫(yī)療保健上，有可能用于研發(fā)延