小鼠卵巢生殖干細(xì)胞的建系及其基因編輯.pdf

1、第一部分小鼠卵巢生殖干細(xì)胞分離及鑒定
　　雌性生殖干細(xì)胞（或稱(chēng)為卵巢生殖干細(xì)胞）具有產(chǎn)生新生卵子的能力，因而為治療卵巢衰老和女性不孕不育打開(kāi)了一扇新的希望之門(mén)。然而，獲得OSCs并對(duì)其進(jìn)行鑒定對(duì)于很多研究者尤其是新手而言是非常困難的。首先這是因?yàn)镺SCs在卵巢組織中量非常稀少，很不容易獲得；其次，在前人的研究中，鑒定OSCs分化為卵子通常是對(duì)卵巢組織切片進(jìn)行免疫熒光或免疫組化染色來(lái)確認(rèn)的；另外前人的研究中都采用鼠源而非人源的STO

2、或者M(jìn)EF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，這點(diǎn)對(duì)于將來(lái)人類(lèi)OSCs的臨床應(yīng)用是有缺陷的。在本研究中為了克服以上弊病我們對(duì)前人的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了適當(dāng)?shù)男薷?。首先我們將卵巢組織消化后鋪到孔板中培養(yǎng)2-3天后再進(jìn)行免疫磁珠分選（MACS）以純化出 OSCs，接著用 EGFP標(biāo)記 OSCs并移植入受體鼠的卵巢中進(jìn)行卵子定向分化的鑒定。受體鼠卵巢以及其后交配得到的胎鼠取出并放在載玻片上置于熒光顯微鏡下直接觀察是否有綠色熒光的卵子或者胎鼠。另外，我們使用人臍帶間充質(zhì)

3、干細(xì)胞（hUC-MSCs）替代 STO/MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)支持OSCs的增殖。結(jié)果表明這些改進(jìn)措施能夠顯著地提高和促進(jìn) OSCs的獲得與鑒定，而且 hUC-MSCs作飼養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)于將來(lái)分離擴(kuò)增人類(lèi)OSCs很有用處，因?yàn)檫@可以避免來(lái)自鼠源的污染。
　　第二部分采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)mOSCs進(jìn)行基因修飾
　　本研究的目的是在mOSCs細(xì)胞系上建立基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)平臺(tái)，為將來(lái)研究與mOSCs

4、干性維持和卵子分化的相關(guān)基因的功能與具體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。mOSCs作為卵子前體干細(xì)胞，它的出現(xiàn)對(duì)于生殖生物學(xué)和婦產(chǎn)科學(xué)的發(fā)展都具有重大意義，然而該干細(xì)胞的干性維持機(jī)制尚不明確，這直接導(dǎo)致目前分離建系mOSCs非常困難；另外mOSCs分化為卵子的過(guò)程和內(nèi)在機(jī)制目前幾乎完全空白，因此有必要對(duì)這兩個(gè)重要科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行研究。mOSCs會(huì)表達(dá)如DDX4、Fragilis、Dazl等生殖系干細(xì)胞marker，如果喪失這些基因表達(dá)會(huì)對(duì)它們的干性產(chǎn)生影響；

5、而B(niǎo)MP4等與卵子分化的基因表達(dá)會(huì)促進(jìn)原始生殖細(xì)胞（PGCS）分化發(fā)育為卵子，那么這些基因會(huì)否對(duì)mOSCs的分化產(chǎn)生相同作用。為了了解清楚這些基因在mOSCs中的功能，可以通過(guò)基因編輯技術(shù)使 mOSCs的這些基因突變而喪失正確的表達(dá)，這些被敲除的基因可以通過(guò)突變的mOSCs的表型變化顯示它們?cè)趍OSCs中的功能和相關(guān)通路。CRISPR-Case9作為目前流行的基因編輯技術(shù)，由于只需要設(shè)計(jì)一個(gè)與靶序列互補(bǔ)的sgRNA質(zhì)粒來(lái)引導(dǎo)Cas9酶蛋

6、白到靶序列位置就可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因突變，因此非常適合用來(lái)改造 mOSCs的基因，實(shí)現(xiàn)本研究的目的。為此，我們首先在293T細(xì)胞系上利用CRISPR-Case9系統(tǒng)驗(yàn)證了GRIN2B基因的突變，隨后將此套技術(shù)應(yīng)用于mOSCs上。出于循序漸進(jìn)之目的，首先驗(yàn)證了mOSCs上Tet2基因的突變，GRIN2B和Tet2都是權(quán)威文獻(xiàn)報(bào)道了的利用 CRISPR-Cas9系統(tǒng)得到基因突變的兩個(gè)基因，選擇它們是為了便于建立此基因改造體系。最后我們?cè)趍OSCs

7、上進(jìn)行了YAP基因的編輯，并隨后通過(guò)Western blot驗(yàn)證其蛋白表達(dá)水平，通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞周期分析驗(yàn)證細(xì)胞增殖能力，通過(guò)Western blot觀察發(fā)生這些改變相關(guān)的通路中的關(guān)鍵分子。結(jié)果顯示我們成功地在293T細(xì)胞、mOSCs上獲得了GRIN2B、Tet2和YAP基因的修飾改造，Western blot也表明YAP蛋白表達(dá)水平與野生型mOSCs相比顯著下調(diào)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示YAP-/--mOSCs增殖能力明顯下降，隨后