簡介：應(yīng)用人源胃癌裸鼠移植瘤模型對胃癌分子生物學(xué)的研究應(yīng)用人源胃癌裸鼠移植瘤模型對胃癌分子生物學(xué)的研究作者姓名陳昊研究生學(xué)號1117219053指導(dǎo)教師倪醒之學(xué)科專業(yè)普通外科學(xué)研究方向胃腸道腫瘤的臨床與基礎(chǔ)研究申請學(xué)位級別碩士學(xué)位培養(yǎng)單位上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院答辯日期2014年4月關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞胃癌；裸鼠移植瘤；分子生物學(xué)特性

簡介：上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文胃癌術(shù)前評估的影像學(xué)及相關(guān)分子生物學(xué)研究姓名嚴超申請學(xué)位級別博士專業(yè)外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師朱正綱20040501上海棼二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文胃癌術(shù)前評估的影像學(xué)及相關(guān)分子生物學(xué)研究中文摘要研究背景準確的胃癌術(shù)前分期是胃癌綜合治療方案實施的需要，在胃癌術(shù)前評估的基礎(chǔ)上，不同分期可選擇相應(yīng)的治療方案。對于IA和IB期胃癌，其手術(shù)效果非常好，部分胃黏膜癌因其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率極低還可行局限性切除術(shù)；對于II和IIIA期胃癌，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性較大，但該組病例行根治性手術(shù)的效果較好，且多能實現(xiàn)R0切除；對于IIIB和IV期胃癌，單純手術(shù)往往難以達到根治的目的，常存在肉眼或鏡下殘留灶，所以多為姑息性切除且不能明顯改善預(yù)后，對于這部分病例有必要行新輔助化療等術(shù)前治療。目前二期L臨床實驗已取得較好的效果。當前有多種方法可應(yīng)用于胃癌術(shù)前分期，如經(jīng)腹超聲檢查TRANSABDOMINALULTRASONOGRAPHY，TAUS、內(nèi)鏡超聲檢查ENDOSCOPICULTRASONOGRAPHY，EUS、CT和磁共振成像MAGNETICRESONANCEIMAGING，MRI。在此，本研究旨在探討上述方法對胃癌術(shù)前評估的臨床應(yīng)用價值。同時，由于影像學(xué)檢查對胃癌N分期均存在一定的局限性，而有研究顯示胃癌淋巴結(jié)狀況可以從分子生物學(xué)角度得到準確的預(yù)測，所以，本研究旨在通過對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)機制淋巴管生成和胃癌細胞向淋巴結(jié)定向移動的研究以進一步探討轉(zhuǎn)移相關(guān)因子淋巴管生成因子VEGFC和趨化因子受體CCR7的檢測對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值。臨床資料和方法對153例經(jīng)胃鏡活檢證實的胃癌患者術(shù)前行內(nèi)鏡超聲檢查，并與術(shù)后病理檢查結(jié)果對照。對64例胃癌患者術(shù)前行經(jīng)腹超聲檢查，其中37例行經(jīng)腹彩色多普勒超聲檢查測定胃癌的彩色多譜勒血管指數(shù)COLORDEPPLERVASCULARITVINDEX，CDVI并采用抗CD34抗體通過免疫組織化學(xué)染色檢測胃癌組織的微血管密度MICROVESSELDENSITY，MVD。對323例胃癌患者術(shù)前行多層螺旋CTMULTIS】ICESPIRALCT，MSCT檢查，在這些病例中。有52例同時行MSCT下CT仿真胃鏡CTVIRTUALGAS臺OSCOPY，CTVG、三維THREEDIMENSION，3D和軸位成像研究，有89例同時行內(nèi)鏡超聲檢查。對27例患者行MSCT和MR／對胃癌術(shù)前TNM分期的比較研究。對118例行胃癌根治術(shù)病例的胃癌組織標本采用免疫組織化學(xué)方法檢測VEGFC和CCR7的表達。

簡介：第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文遺傳性脊髓小腦共濟失調(diào)的臨床與分子生物學(xué)研究姓名韓燕申請學(xué)位級別博士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師鄭惠民丁素菊20030401≯二筍垂Z移爐礱鏟蘊巷遺傳性脊髓小腦共濟失調(diào)的臨床與分子生物學(xué)研究中文摘要常染色體顯性遺傳性小腦共濟失調(diào)ADCA，是一大組遺傳昴質(zhì)性的神經(jīng)變性痰瘸，其特征是進行性小腦、腦干和脊髓變性。HARDING分別襁1982年和1993年攝爨根據(jù)L豳床表現(xiàn)將ADCA分為三戮ADCAL型，主要襲現(xiàn)為進亍性小藏瞧羅若濟失調(diào)，蠢驤終蠢蕤鼴癱痹、橇秘縫贅繚、錐囂寨／錐體羚系癥獲察癡呆；ADCAH型，又名SCAT型，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素變性和小腦餓拭濟失調(diào)，可伴有眼肌麻痹和錐體束，錐體外系表現(xiàn)；ADCAIII型通常指純粹的小腦綜合征。1993年以來，隨著分予遺傳學(xué)的發(fā)展，躺CA相關(guān)致病基因陸續(xù)被克隆，兩穗寢念名為速簧牲脊髓參藏共濟失調(diào)SCAS，毽撬SCAI。8、SCAIO15秘齒狀投緞核一蒼白球最躺下部核萎縮。隨后2001年首次報道SCAL6和SCAL7，2002年又首次報道了SCAL9?，F(xiàn)已證實突變赫圓編碼區(qū)的CAG／CTG三核苷酸重復(fù)序列擴展突變?yōu)樵擃愄挡〉闹虏≡?，其熬性表現(xiàn)有1CAGN重復(fù)序列代瓣傳遞不穩(wěn)定性，褥遺傳早璦現(xiàn)象；2CAGN重復(fù)數(shù)與發(fā)病年齡呈受援關(guān)，與疾癱嚴重程凄黧聶相關(guān)；3父系遺緒效應(yīng)。不同地域、不同人種的SCAS發(fā)病類型也不同，其差異與種族和遺傳背景不同有關(guān)，但較一致的認為SCA3／MACHADOJOSEPH病MJD是最常見的類型。ADCAII型又名SCA7型及橄欖核橋腦，』、腦萎縮半視網(wǎng)膜變性，是一種罕見的迸震羧襻經(jīng)一漿摹毒疾痰，與冀宅SCAS不弱點麓穆毒撬闕驥色素變羧，感蠹表袋為稅敏度下降和異常的色覺辨剮力。中國SCAS患者中，SCA3／MJD為主要類型，均無葡萄牙血緣關(guān)系，為非黼萄牙MJD型，SCAL少見，SCA7罕見，近3年來國內(nèi)才陸續(xù)報道了數(shù)個SCA7家系。出于餐型之闖臨床表璇棵重疊，竣僅欞攢贛寐表現(xiàn)對SCAS掰終熬勢型表受努整并不確留，淹羞SCAS穩(wěn)美致病基爨陵續(xù)克隆，墓困突變捻測為韭乏類疾病建立了個確切診斷的分類方法基因分型，采用基因突變分析使得基因跨斷、癥狀|JI『滲斷成為現(xiàn)實。我們調(diào)套了表現(xiàn)為視力下降、辨色力異常翹菸濟失調(diào)蛉1個曬床診斷為

簡介：胰島素抵抗INSULINRESISTANCEIR是指由于胰島素在周圍組織攝取和清除葡萄糖的作用減低使其不能發(fā)揮正常效應(yīng)的病理生理狀態(tài)已有的研究表明肥胖可以通過脂肪細胞胰島素受體、受體后結(jié)構(gòu)及表達的異常最終將導(dǎo)致脂肪組織IR的發(fā)生而IR又正是導(dǎo)致包括肥胖癥、糖尿病、高血壓病、動脈粥樣硬化癥、脂質(zhì)代謝異常等一系列病理狀態(tài)在內(nèi)的代謝綜合征的共同危險因素由于這一惡性循環(huán)的存在對肥胖及IR的研究已經(jīng)越來越成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點然而對肥胖機制的研究長期徘徊直到1994年首次成功分離小鼠的肥胖相關(guān)基因OB基因并發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)LEPTIN進而于1998年在尋找與孤兒G蛋白受體相連接的配基時發(fā)現(xiàn)兩種神經(jīng)肽EXINA和B其中樞作用與LEPTIN截然相反這樣對肥胖相關(guān)激素和神經(jīng)肽的研究才進入了嶄新的階段目前已知EXINLEPTIN相互作用共同參與能量代謝及內(nèi)分泌等多種功能的調(diào)控因此該課題將研究重點確定為IR動物模型EXINLEPTIN表達及其調(diào)控機制的分子生物學(xué)研究第一部分膳食誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠模型建立及鉗夾技術(shù)評價目的該研究擬通過高果糖或高脂肪飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)建立IR大鼠模型并采用判定IR模型是否復(fù)制成功的金標準即高血漿胰島素正常血糖鉗夾技術(shù)HYPERINSULINEMICEGULYCEMICCLAMPTECHNIQUE簡稱鉗夾技術(shù)對模型進行評價確立成功復(fù)制和評價IR大鼠模型的有效方法結(jié)論1該研究通過改變膳食結(jié)構(gòu)中碳水化合物及脂肪熱卡比例建立了高果糖及高脂肪膳食誘導(dǎo)IR大鼠模型鉗夾技術(shù)證明大鼠GIR低于正常對照組INS敏感性下降提示我們復(fù)制IR大鼠模型成功2建立了有效評價INS敏感性的金標準鉗夾技術(shù)該研究中GIR在512MGKGMIN范圍內(nèi)大鼠的凈輸入液體量為225ML細胞外液量的改變?yōu)?3％左右這些指標均接近文獻報道提示我們采用的鉗夾技術(shù)方法比較可靠、準確、穩(wěn)定而GIR與ISI間較好的相關(guān)性提示我們在實驗條件有限的情況下ISI也能夠較為客觀地反映機體胰島素的敏感性尤其在流行病學(xué)調(diào)查等大樣本研究中因其檢測技術(shù)簡便具有很大的實用價值3兩種膳食誘導(dǎo)IR大鼠模型中高脂肪膳食誘導(dǎo)模型的各項IR相關(guān)指標變化多數(shù)較高果糖膳食誘導(dǎo)模型更為明顯提示我們高脂肪膳食在誘導(dǎo)IR模型中可能更為經(jīng)濟更為可靠而高果糖膳食模型成功的意義更傾向于對飲食結(jié)構(gòu)的重新認識因為果糖正作為減輕體重鍛煉耐力有益于糖尿病的健康飲食而被廣泛提倡且有由西方人向東方人推廣的趨勢第二部分膳食誘導(dǎo)IR大鼠模型EXINLEPTIN系統(tǒng)及其影響因素的研究目的由于IR是導(dǎo)致包括肥胖癥、2型糖尿病的代謝綜合征的共同危險因素因此我們非常關(guān)注IR與EXINLEPTIN系統(tǒng)之間的相互關(guān)聯(lián)該研究擬采用RTPCR方法對膳食誘導(dǎo)并經(jīng)鉗夾技術(shù)證實的IR動物模型中EXINLEPTIN及其受體MRNA表達情況進行檢測同時分析IR狀態(tài)下參與EXINLEPTIN系統(tǒng)調(diào)控的可能因素結(jié)論1高果糖及高脂肪膳食誘導(dǎo)的IR大鼠模型中下丘腦PREPROEXIN表達減少OXR、OXR表達增加脂肪組織中LEPTINMRNA表達增加下丘腦LEPTIN受體LRMRNA表達減少其中高脂肪膳食誘導(dǎo)IR大鼠模型中上述變化更為明顯提示EXIN與LEPTIN是機體能量平衡調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的一對重要物質(zhì)二者相互調(diào)控共同維持機體能量代謝的穩(wěn)定EXIN與LEPTIN相互調(diào)控機制的闡明將有助于我們通過增加LEPTIN和或LEPTIN的敏感性應(yīng)用選擇性的EXIN受體拮抗劑以達到治療肥胖和IR的目的2該模型中血清胰島素、葡萄糖、血脂水平及IR相關(guān)的重要指標FFA、TNFΑ等均可能成為與EXIN系統(tǒng)相互調(diào)控的內(nèi)分泌代謝因素這些調(diào)控的深層次機制還有待于進一步的研究闡明第三部分葡萄糖對EXIN系統(tǒng)的調(diào)節(jié)目的EXIN除了參與攝食、睡眠覺醒的調(diào)控外還是涉及內(nèi)分泌代謝調(diào)節(jié)的重要因素尤其是EXIN與葡萄糖和胰島素之間的相互關(guān)聯(lián)因脂肪胰島軸的存在以及在肥胖癥、糖尿病發(fā)病和治療中的重要意義而倍加引人關(guān)注因此該文著重就葡萄糖對EXIN在中樞及周圍系統(tǒng)胰腺表達的調(diào)控及其作用機理加以闡述希望可以確定如下幾個問題1胰島素介導(dǎo)的低血糖對大鼠下丘腦EXIN系統(tǒng)表達的影響2胰腺組織中是否有PREPROEXIN及其受體表達3胰腺中PREPROEXIN及其受體表達是否被葡萄糖調(diào)節(jié)4不同濃度葡萄糖對胰島細胞增殖情況的影響及意義結(jié)論1急性INS誘導(dǎo)低血糖伴禁食狀態(tài)刺激下丘腦PREPROEXIN表達但對受體OXR尤其是OXR表達影響不顯著提示下丘腦EXIN神經(jīng)元被血糖下降激活被與進食相關(guān)的信號抑制因此在維持葡萄糖可獲得性的血糖穩(wěn)態(tài)進食機制中EXIN神經(jīng)元的作用顯示出十分重要的地位2原位雜交法證實胰島細胞胞漿中有PREPROEXIN及OXRMRNA的表達提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)外EXIN的存在且EXIN可以作為一個循環(huán)激素和或自分泌及旁分泌物質(zhì)起作用參與能量平衡及內(nèi)分泌代謝3胰腺中的EXIN神經(jīng)元與下丘腦及腸道中一樣均是葡萄糖敏感的是血糖水平下降時被活化的葡萄糖感覺網(wǎng)絡(luò)的一部分當葡萄糖濃度改變時培養(yǎng)胰島細胞中EXIN及其受體MRNA的表達發(fā)生相應(yīng)改變4培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的改變將會影響胰島細胞的增殖情況偏離正常血糖后無論濃度升高或降低細胞增殖指數(shù)均下降但胰島細胞的這一特性并不是導(dǎo)致EXIN系統(tǒng)發(fā)生變化的原因

簡介：中南大學(xué)博士學(xué)位論文一氧化氮對前列腺癌發(fā)生發(fā)展的影響及其相關(guān)分子生物學(xué)研究姓名龍智申請學(xué)位級別博士專業(yè)外科學(xué)指導(dǎo)教師蔣先鎮(zhèn)20050501博士學(xué)位論文中文摘要前列腺癌患者手術(shù)切除的病理石蠟標本作為實驗組，10例良性前列腺增生組織的石蠟包埋組織塊作為對照組，采用鏈霉菌抗生素蛋白一過氧化酶連接法SP法進行免疫組化染色，所有標本經(jīng)過病理復(fù)診明確診斷。檢測所用的是一抗為兔抗人INOS蛋白抗體和鼠抗人P53蛋白抗體。根據(jù)染色的強弱程度，分別運用肉眼計數(shù)法、病理圖像自動分析儀進行分析，并對這兩種方法進行比較。結(jié)果肉眼計數(shù)法前列腺癌石蠟切片INOS免疫組化染色28例均陽性，其中弱陽性4例1429％，陽性15例5357％，強陽性為9例3214％；前列腺增生組織切片有1例強陽性10％，5例陽性50％，3例弱陽性30％，1例陰性10％。兩者之間無差異戶L005。方法二前列腺癌石蠟切片INOS免疫組化染色28例均陽性，其中強陽性13例4643％，陽性15例5357％；前列腺增生石蠟切片有6例陽性60％，4例弱陽性40％。兩種方法有差異，光密度法的陽性程度要明顯高于肉眼統(tǒng)計法尸O05。而根據(jù)前列腺癌臨床分期，A期5例1786％，平均光密度值為O1920O033B期12例4286％，平均光密度值為0。1933O035；C期8例2857％，平均光密度值為01938O045；D期3例1071％，平均光密度值為017330084。同樣通過F檢驗證實，INOS免疫染色的平均光密度值與前列腺癌的臨床分期沒有明顯的關(guān)系F0185，PO05。前列腺癌P53染色的平均光密度值為01214O088，28例前列腺癌中17例6071％P53陽性染色，其中強陽性7例25％，陽性8例2857％，弱陽性2例714％；11例染色陰性，占3929％。而10例良性前列腺增生的病理組織切片染色均陰性，平均光密度值僅為00300012。實驗組與對照組之間有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異1I

簡介：冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是心血管疾病死亡的重要因為之一血管支架植入治療已經(jīng)成為一個標準的血管成形術(shù)方法但是血管支架植入后因組織增生和血栓形成引起的再狹窄成為血管支架在臨床應(yīng)用中所面臨的主要問題。藥物涂層支架的出現(xiàn)使再狹窄率大大降低在臨床上取得了許多突破性進展。目前各類抑制再狹窄的藥物涂層血管支架成為研究的熱點本論文制備了多種含抑制組織增生和抗凝血藥物的聚合物涂層薄膜并采用多種細胞相容性評價方法對載藥涂層的抗增生行為進行了較為系統(tǒng)的評價。本論文選用已獲得美國FDA批準應(yīng)用于臨床的可降解高分子材料乙交酯丙交酯共聚物PLGALAGA1585作為各種藥物涂層的高分子載體制備了載不同種類藥物姜黃素、雷帕霉素、肝素、姜黃素肝素、姜黃素雷帕霉素、肝素雷帕霉素、不同藥物濃度不同混合藥物比的藥物涂層將不載藥的PLGA涂層和裸316L不銹鋼作為對照樣。通過四唑藍比色法MTT細胞活性實驗對藥物濃度進行了篩選；運用檢測乳酸脫氫酶LDH實驗評價了載藥涂層薄膜對血管平滑肌細胞是否具有急性毒性反應(yīng)；利用阿爾瑪藍ALAMARBLUE檢測方法評價了載藥薄膜是否能夠抑制血管平滑肌細胞和人臍內(nèi)皮細胞的增殖同時有選擇的對每組樣品中取樣進行46聯(lián)脒2苯基吲哚DAPI染色實驗以直觀評價薄膜樣品表面平滑肌細胞數(shù)目。通過MTT結(jié)果分別計算了各種藥物的半數(shù)生長抑制濃度其中姜黃素藥物半數(shù)生長抑制濃度IC50為052ΜGML雷帕霉素半數(shù)生長抑制濃度IC50為288NGML。姜黃素和雷帕霉素兩種藥物聯(lián)用后對平滑肌細胞的抑制作用較同濃度單用時效果增強合用指數(shù)CI089小于1發(fā)揮協(xié)同作用。LDH結(jié)果表明載不同濃度姜黃素、雷帕霉素、肝素的PLGA薄膜及不同比例的姜黃素肝素、姜黃素雷帕霉素、肝素雷帕霉素混合藥物的PLGA薄膜均未表現(xiàn)出急性毒性反應(yīng)。與參照樣不銹鋼相比ALAMARBLUE和DAPI染色結(jié)果表明三種濃度10WT％20WT％和30WT％載姜黃素的PLGA薄膜均表現(xiàn)出對平滑肌細胞的顯著性抑制作用；載雷帕霉素的PLGA薄膜對平滑肌細胞同樣具有抑制作用；肝素載藥薄膜也表現(xiàn)出了對平滑肌細胞有一定的抑制作用；對于載姜黃素和雷帕霉素混合藥物薄膜當姜黃素雷帕霉素混合比為55時的載藥PLGA薄膜抑制平滑肌細胞增殖的能力最強；對于載姜黃素肝素不同混合比的PLGA薄膜當姜黃素肝素混合比為73時的抑制效果較強；對于載雷帕霉素肝素不同混合比的PLGA薄膜當雷帕霉素肝素混合比為73時的抑制效果較強。人臍靜脈內(nèi)皮細胞與載藥PLGA薄膜和純PLGA薄膜共培養(yǎng)3天對內(nèi)皮細胞增生具有不同程度的抑制作用。

簡介：點擊查看更多香豆素類植物雌激素防治骨質(zhì)疏松的分子生物學(xué)機制研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文卵圓細胞在轉(zhuǎn)化和分化過程中的生物學(xué)特征及其分子調(diào)控機制的初步探討姓名劉君申請學(xué)位級別碩士專業(yè)病理學(xué)指導(dǎo)教師薛玲20060512卵圓細胞在轉(zhuǎn)化和分化過程中的生物學(xué)特征及其分子調(diào)控機制的初步探討標志物。。。這提示肝干細胞卵圓細胞、肝細胞和肝癌細胞問存在著復(fù)雜的內(nèi)在聯(lián)系，如何調(diào)控其分化成為問題的關(guān)鍵，也是目內(nèi)外眾多學(xué)者研究的熱點。然而，經(jīng)過數(shù)十年的探討，關(guān)于卵圓細胞分化、轉(zhuǎn)化凋控的機制現(xiàn)今仍不十分清楚。其在何種條件下向正常方向分化何種條件下發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化其分子機制等均未闡明。針對以上研究現(xiàn)狀，我們試圖尋找啕；途徑，能夠連續(xù)、動態(tài)地觀察卵圓細胞不同分化狀態(tài)下的生物學(xué)特征，并借助高通量、簡便快捷的分子遺傳學(xué)分析技術(shù)，全面深入地探求調(diào)控卵圓細胞分化方向的關(guān)鍵因子，明確干細胞分化為成熟肝細胞和肝癌細胞的分水嶺。這一研究不僅具有重要的理論意義一一有助于我們深入了解肝臟以及肝臟腫瘤的發(fā)生機制，也具有巨大的應(yīng)用價值一一今后將卵圓細胞安全地應(yīng)用于臨床干細胞治療。實驗?zāi)康脑噲D通過建立動態(tài)的觀察體系，探求卵圓細胞自發(fā)轉(zhuǎn)化和濤導(dǎo)分化過程中的演變規(guī)律、生物學(xué)特征，分析相關(guān)的分子機制，以期對肝臟的發(fā)生學(xué)和肝癌的癌變機制提供實驗依據(jù)。實驗方法復(fù)蘇肝臟卵圓細胞0C3第18代P18，在分別加入細胞因子EGFA組和HGFEGFB組的培養(yǎng)條件下長期體外培養(yǎng)，運用常規(guī)細胞生物性狀檢測指標以及免疫細胞化學(xué)、半定量RTPCR等技術(shù)，觀察0C3在不同條件下的分化狀態(tài)，并運用蛋白芯片技術(shù)分析該過程中蛋白表達譜的改變。實驗結(jié)果和結(jié)論為了鑒定所復(fù)蘇的細胞的性質(zhì)，實驗前期對其進行了形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)等指標的檢測。其結(jié)果表明，這種細胞為卵圓形核，體積小約為10UM，胞漿少。電子顯微鏡顯示為原始未分化細胞之超微結(jié)構(gòu)特點；OV一6、CKIT等干細胞標志陽性，表明這種細胞是建株之卵圓細胞。1、細胞在表皮生長因子EGF的作用F維持生長培養(yǎng)至66代，在一般形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及生物學(xué)性狀等方面，均發(fā)生了明顯變化，已經(jīng)符合轉(zhuǎn)化細胞條件。這表明，化學(xué)致癌劑誘發(fā)增生的卵圓細胞，在體外培養(yǎng)能維持生II

簡介：GRAVES病GD是一種常見的公認的器官特異性自身免疫病目前認為促甲狀腺激素受體TSHR是GD的主要抗原TSHR抗體TRAB是GD的重要效應(yīng)因子并且是GD發(fā)病中較靠下游的環(huán)節(jié)因此尋找GD發(fā)病的啟動因子成為GD免疫致病機制研究的熱點問題共刺激分子及其介導(dǎo)的共刺激信號在特異性免疫應(yīng)答過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用尤其在T細胞的活化、增殖、失能、凋亡等方面起著極為關(guān)鍵的決擇作用在自身免疫性疾病中共刺激分子的表達異常引起自身反應(yīng)性T細胞的過度活化逃脫外周耐受而致病該課題以GRAVES病作為研究對象探討一系列共刺激分子在GD患者甲狀腺組織和原代培養(yǎng)的甲狀腺濾泡細胞上的表達及其生物學(xué)意義并在體外研究共刺激信號對原代培養(yǎng)的甲狀腺濾泡細胞生物學(xué)行為的影響進一步闡明GD免疫致病機制的始動環(huán)節(jié)為在此基礎(chǔ)上采用免疫干預(yù)治療以達到根治GD提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)針對GD患者外周血中存在的自身反應(yīng)性CD4CD28T細胞采用細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等手段研究其生物學(xué)特性及其臨床意義探討其作為GD嚴重性、活動性及預(yù)后判斷的免疫學(xué)指標的可行性并為GD的免疫治療開辟新思路

簡介：碩士研究生趙穎碩士生導(dǎo)師章強強教授導(dǎo)師組成員朱敏主治醫(yī)師李莉主管技師陳馳宇助理研究員復(fù)旦學(xué)頸學(xué)位論文_●●_一中文摘要。第一部分馬拉色菌屬的分類及其在常見皮膚病的分布情況口目的研究馬拉色菌屬的分類及其在兩種常見馬拉色菌相關(guān)疾病中的分布情況方法以標準株作為對照采用PCR擴增RDNAITS2區(qū)并測序的分子生物學(xué)方法將來源于花斑糠疹和馬拉色菌毛囊炎的馬拉色菌進行分類和描述，分析各菌種在這兩種疾病的分布情況。結(jié)果在135例花斑糠疹和馬拉色菌毛囊炎分離到6個菌種，共114株馬拉色苗。鑒定出球形馬拉色菌47株4I％、合軸馬拉色菌40株35％、糠秕馬拉色菌20株175％、鈍形馬拉色苗4株35％、大和馬拉色菌2株18％、皮炎馬拉色菌1株09％。兩種疾病菌種構(gòu)成與疾病類型有關(guān)，近半數(shù)花斑癬患者皮損中分離出合軸馬拉色菌，大部分馬拉色菌毛囊炎中分離出球形馬拉色菌。結(jié)論不同疾病馬拉色菌菌種構(gòu)成不同，球形馬拉色菌與馬拉色菌毛囊炎密切相關(guān)馬拉色菌RDNA的1TS2區(qū)PCR擴增與測序可用于馬拉色苗的分類鑒定。第二部分利用BI。LOG微生物自動分析系統(tǒng)建立常見馬拉色菌的鑒定數(shù)據(jù)庫目的利用BIOLOG微生物自動分析系統(tǒng)建立常見馬拉色菌的鑒定數(shù)據(jù)庫，探討該系統(tǒng)箍定馬拉色苗的應(yīng)用前景。方法采用表型及PCR擴增、測序的方法將臨床收集的菌株鑒定至種；選取臨床最常見的糠秕、合軸和球形馬拉色菌，接種于FF微孔板，記錄常見馬拉色菌對95種不同碳源的利用情況描述其各自的生眭反應(yīng)譜，建立鑒定數(shù)據(jù)庫。結(jié)果三種馬拉色菌中絕大韶分菌株可以利用吐溫80、糊精所有馬拉色菌菌株均不能利用B環(huán)式糊精、D半乳糖醛酸、癸二酸；三種馬拉色苗對碳源的利用具有明顯的差別T而同種馬拉色菌對碳源的利用趨勢基本相同。糠秕馬拉色菌可以

簡介：第一部分牽張力介導(dǎo)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的表達及其對平滑肌細胞功能影響的研究血管重構(gòu)被公認為高血壓、冠心病等心血管疾病的重要病理特點，它是指血管管腔面積及形態(tài)、管壁結(jié)構(gòu)和成分、血管功能的慢性改變。機械性損傷、炎癥、低氧、血流動力學(xué)異常等多種因素均參與血管重構(gòu)的形成。由于血管一直暴露于血流動力學(xué)的作用中，異常的血液流體力學(xué)在血管重構(gòu)中的作用及其分子機制，受到國內(nèi)外學(xué)者越來越多的關(guān)注。深入研究血管重構(gòu)的分子機制，確定在這一過程中發(fā)揮重要作用的分子和潛在藥物靶點，對于預(yù)防和減少心血管疾病的死亡率具有重大意義。人體血管長期暴露于搏動性血流的沖擊下，主要承受著兩種形式的生物力，一種是平行于血管長軸的剪切力SHEARSTRESS，主要作用于血管內(nèi)皮細胞另一種是垂直于血管長軸的牽張力STRETCHSTRESS，可影響血管壁各種細胞成分，但位于管壁中層的平滑肌細胞是其主要靶細胞。兩種生物力對于血管功能的調(diào)節(jié)均具有重要作用。研究認為，平滑肌細胞受到牽張力的刺激時，其胞膜表面的各種受體分子、離子通道等將膜外機械性的刺激信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的生物信號，激活一系列胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及轉(zhuǎn)錄因子，通過影響相關(guān)基因的表達調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、分化等生物學(xué)功能。腎素血管緊張素（RAS）系統(tǒng)是影響血管形態(tài)與功能的重要因素。由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE催化產(chǎn)生的血管緊張素ⅡANGⅡ是RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，它在心血管重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。ANGⅡ不僅具有直接刺激平滑肌細胞增殖、遷移等功能改變的作用，還介導(dǎo)牽張力對平滑肌細胞生物學(xué)功能的影響與相應(yīng)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞和成纖維細胞中，牽張力刺激能夠誘導(dǎo)心肌細胞分泌ANGⅡ，而且不依賴于ANGⅡ而上調(diào)腎素、ACE、AT1R、AT2R等基因的表達，而在心肌成纖維細胞中則沒有上述作用，這說明牽張力本身具有獨立調(diào)控局部RAS系統(tǒng)基因表達的作用，而且具有一定的細胞特異性。新近的研究也表明是組織局部RAS，而不是循環(huán)RAS和炎癥因子，對高血壓性心血管重構(gòu)起著重要作用。因此，進一步探索血管局部RAS系統(tǒng)在牽張力介導(dǎo)的血管生物學(xué)功能中的作用及其機制具有重要的臨床意義。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2ACE2是一個新發(fā)現(xiàn)的RAS系統(tǒng)成員，對其生物學(xué)功能的研究成為近年來的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2具有降解ANGⅡ生成血管緊張素17ANG17的作用，后者通過其特異的MAS受體，拮抗ACEANGⅡ信號通路的不良生物學(xué)作用，其被認為是RAS系統(tǒng)的負性調(diào)節(jié)因子，也是參與心血管重構(gòu)的重要分子。此外，如RAS系統(tǒng)其它組分一樣，實驗證實生物力學(xué)因素也可以調(diào)節(jié)ACE2的表達。ACE2在血管內(nèi)皮細胞及動脈平滑肌細胞中均有表達，其組織特異性表達及其對關(guān)鍵血管活性肽ANGⅡ獨特的分解能力，提示它在血管局部RAS中扮演重要角色。與RAS系統(tǒng)的ACEANGⅡAT1R軸相比，ACE2與生物力學(xué)的關(guān)系目前還知之甚少。由于ACE2在心血管重構(gòu)中的保護作用及其對心血管細胞增殖、遷移、膠原代謝等生物學(xué)功能的影響，我們推測其在牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能中發(fā)揮重要作用?；诮陙淼难芯繉CE2在血管平滑肌細胞功能中作用的闡述，以及牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能的重要性，我們特提出以下科學(xué)假說1牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞ACE2的表達，不同強度的牽張力對ACE2表達的影響不同2牽張力影響包括ACE2在內(nèi)的RAS系統(tǒng)各主要成分的表達，ACE2ANG17MAS軸與ACEANGⅡAT1R軸在牽張力作用下，相互對抗、相互影響，參與不同大小牽張力對平滑肌細胞生物學(xué)作用的影響。研究目的1在體外細胞研究中，明確牽張力對血管平滑肌細胞ACE2表達及活性的影響。2明確ACE2在牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細胞生物學(xué)功能中的作用。3通過體內(nèi)實驗驗證力學(xué)對血管平滑肌細胞ACE2表達的影響。研究方法1細胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞HASMCS，待細胞生長融合后，PBS沖洗細胞兩遍，以去除血清，加025％胰蛋白酶在細胞培養(yǎng)箱中消化2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察到細胞變圓時，吸出胰蛋白酶，加入新的完全培養(yǎng)基吹打混勻，轉(zhuǎn)入新的細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2平滑肌細胞牽張力干預(yù)分組接種平滑肌細胞至鋪有Ⅰ型膠原的FLEXCELL六孔板中，待細胞生長至90％融合時，采用無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)細胞靜止24H，然后更換新的完全培養(yǎng)基，利用FLEXCELL5000TENSION細胞拉力儀給予細胞牽張力刺激，具體分組如下1靜止對照組不給予牽張力刺激，其它條件與牽張力干預(yù)組相同210％牽張力組給予最大峰值為10％的周期性牽張力分別刺激細胞1、3、6、12、24小時，牽張頻率為1HZ315％牽張力組給予最大峰值為15％的周期性牽張力分別刺激細胞1、3、6、12、24小時，牽張頻率為1HZ在各個時間點，不同強度牽張力干預(yù)平滑肌細胞結(jié)束后，連同靜止對照組一起收集細胞分別提取蛋白與總RNA，80℃保存待測血管緊張素ⅡANGⅡ及血管緊張素17含量（ANG17）。3細胞存活率檢測平滑肌細胞經(jīng)不同強度牽張力刺激12小時后，胰酶消化的方法收集細胞，PBS重懸，臺酚藍染色液染色5分鐘，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，計算細胞存活率。細胞存活率（細胞總數(shù)藍色細胞數(shù)）細胞總數(shù)100％。4實時熒光定量PCR檢測ACE2、ACE、MASMRNA表達根據(jù)試劑盒說明，用TRIZOL提取入主動脈平滑肌細胞總RNA，用TAKARA試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，在BIORAD公司生產(chǎn)的IQ5上進行實時定量PCR。每個樣本重復(fù)測量三次。ACE2擴增引物序列上游5’CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT3’，下游5GAGCTAATGCATGCCATTCTCA3’ACE擴增引物序列上游5GCGGCTCTTCCAGGAGCTGC3’，下游5’CTGCGCCCACATGTTCCCCA3’MAS擴增引物序列上游5’GGCCTCCTCATGGATGGGTCAA3’，下游5’GTGCATTCCCGACTGAGGCGT3’ΒACTIN擴增引物序列，上游5TGACGTGGACATCCGCAAAG3’，下游5’CTGGAAGGTGGACAGCGAGG3。反應(yīng)結(jié)束得到CT值（循環(huán)閾值），用相對定量的方法計算2ΔΔCT，并分析數(shù)據(jù)。ACE2、ACE、MASMRNA表達以管家基因ΒACTIN進行標準化。5WESTERNBLOT收集細胞后，提取胞漿胞膜總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，在99℃煮沸10分鐘，SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶封閉，用1TBST洗膜3次。將PVDF膜放入合適比例的一抗中，4℃孵育過夜，洗膜。合適比例的二抗孵育1小時，洗膜，最后采用MILLIPE顯色液進行發(fā)光，柯達膠片顯影完成后觀察結(jié)果。6ACE2活性測定各種條件干預(yù)后收集細胞，提取胞漿蛋白。采用7MCAYVADAPKDNP作為反應(yīng)底物，ACE及ACE2都能分解這一底物的2，4二硝基苯基部分，而2，4二硝基苯基能夠淬滅7甲氧基香豆素部分的熒光，它的分解造成熒光增強。20ΜG的總蛋白提取物與10ΜMOLL7MCAYVADAPKDNP混合后室溫下孵育，終容積為100ΜL。采用酶標儀讀取激發(fā)光320NM及散射光400NM的熒光強度，動態(tài)讀取熒光值4小時。ACE2活性定義為ACE2活性無抑制劑時的熒光強度ACE2抑制劑DX600存在時的熒光強度。每個樣本測量三次，最后數(shù)值采用RFUMGHOUR。7ANG17及ANGⅡ產(chǎn)物測定不同水平牽張力干預(yù)平滑肌細胞后，收集胞漿蛋白，ELISA法檢測胞漿蛋白中ANG17及ANGⅡ的含量。8細胞免疫熒光法檢測ACE2的表達HASMCS接種于FLEX5000TENSION6孔板中，至細胞生長至90％融合時，更換無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)細胞靜止24小時后，分為兩組，即靜態(tài)組、10％牽張力干預(yù)12小時組。干預(yù)結(jié)束后棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入免疫染色固定液固定30MIN，PBS沖洗，剪下種有細胞的膜，采用免疫熒光染色，滴加相應(yīng)抗體血清，再滴加1∶200熒光素標記的二抗，設(shè)陰性及空白對照。熒光顯微鏡下觀察、拍片，直觀明確牽張力對平滑肌細胞中ACE2的表達是否有作用。9細胞轉(zhuǎn)染利用陽離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染不同濃度的ACE2小干擾RNAACE2SIRNA及陰性對照小干擾RNANEGATIVECONTROLSIRNA，ACE2SIRNA序列為FWARD5CCAUCUACAGUACUGGAAADTDT3REVERSE5UUUCCAGUACUGUAGAUGGDTDT3。NEGATIVECONTROLSIRNA序列為FWARD5UUCUCCGAACGUGUCACGUDTDT3REVERSE5ACGUGACACGUUCGGAGAADTDT3，。轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，提取胞漿總蛋白，WESTERNBLOT測定ACE2蛋白表達以評價干擾效果，選取合適的SIRNA濃度按照合適的SIRNA濃度進行下一步實驗。10ACE2在牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細胞生物學(xué)功能中作用的研究1培養(yǎng)HASMCS，給予生理范圍的牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激12H。2采用BRDU摻入法、細胞劃痕技術(shù)，明確牽張力對HASMCS增殖、遷移的影響。3預(yù)先轉(zhuǎn)染ACE2小干擾RNASIRNA及其陰性對照后再給予牽張力干預(yù)，觀察對上述平滑肌細胞生物學(xué)功能的影響，明確ACE2在牽張力調(diào)節(jié)HASMCS生物學(xué)功能中的作用。11體內(nèi)實驗觀察壓力負荷改變對血管平滑肌細胞ACE2表達的影響1動物模型構(gòu)建20只12周齡雄性C57BL6小鼠，分為兩組，手術(shù)組N10，假手術(shù)組N10。手術(shù)組自胸骨上窩結(jié)扎主動脈弓部致其縮窄，假手術(shù)組術(shù)式與手術(shù)組相同，但不做主動脈弓縮窄。并分別于術(shù)后24小時后處死動物留取標本。2壓力負荷改變與主動脈平滑肌細胞中ACE2表達的關(guān)系應(yīng)用實時定量PCR、WESTERNBLOT技術(shù)分別測定主動脈弓結(jié)扎上、下游血管段ACE2的MRNA和蛋白表達水平免疫組化雙染測定ACE2在血管平滑肌細胞中的表達。12統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤MEAN±SEM表示，兩兩比較采用T檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，使用SPSS160統(tǒng)計軟件分析，P＜005認為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1不同作用時間下，不同水平的牽張力對主動脈平滑肌細胞ACE2、ACE、MASMRNA表達的影響研究結(jié)果顯示，ACE2與ACE、MAS均為牽張力敏感的RAS基因。與靜態(tài)對照組比較，10％牽張力作用后1小時ACE2、MAS、ACEMRNA水平與靜態(tài)對照組相比未見明顯改變P＞005），作用3H后ACE2MRNA水平比靜態(tài)對照組明顯增高，于6H達峰31FOLD，P＜001，而且增高趨勢保持到24H，MASMRNA水平自3H開始上升，6H達到峰值24FOLD，P＜001，24小時仍比靜態(tài)對照組明顯增高，而ACEMRNA水平在1H、3H時輕度增高但無顯著性意義，在10％牽張力作用12H、24H時ACEMRNA水平較靜態(tài)組明顯降低041FOLD，P＜005與靜態(tài)對照組比較，15％牽張力作用3H后，ACE2、MASMRNA水平比靜態(tài)對照組表達增高分別為18FOLD，165FOLD，P＜001，P＜005，15％牽張力作用12、24小時后，其ACE2、MASMRNA水平比靜態(tài)對照組明顯降低037FOLD，044FOLD，P＜005，而ACEMRNA水平在15％牽張力作用6H顯著增高，12H達峰235FOLD，P＜001，于24H仍較靜態(tài)組明顯增加219FOLD，P＜001將PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示ACE2于108BP、ACE于142BP、MAS于94BP處顯示清晰的條帶。為了觀察RAS系統(tǒng)中兩個主要的酶對相同牽張力的不同反應(yīng)，我們比較了相同牽張力情況下ACE2及ACE的變化情況，結(jié)果表明在10％的牽張力作用下1小時，ACE2比ACE明顯上調(diào)P＜005，而繼續(xù)牽張3H至24H，與ACE的MRNA水平相比，ACE2始終明顯高表達P＜001而15％的牽張力作用1小時、3小時，ACE2與ACE的MRNA表達沒有顯著性差異，繼續(xù)牽張至6小時，ACE的MRNA表達較ACE2明顯上調(diào)P＜005，至12、24小時，ACE的MRNA表達保持顯著上調(diào)P＜001。2WESTERNBLOT結(jié)果WESTERNBLOT結(jié)果顯示，10％牽張力干預(yù)細胞1、3小時，ACE2蛋白表達未見有明顯改變P＞005，干預(yù)HASMCS6小時后，ACE2蛋白表達較靜態(tài)對照組明顯升高（P＜001），10％牽張力干預(yù)24小時之后，ACE2蛋白表達水平仍然增高P＜001而15％牽張力刺激細胞3小時后，引起ACE2蛋白表達水平短暫升高P＜001），而在12、24小時，ACE2表達呈明顯下調(diào)趨勢P＜001。3ACE2活性變化10％牽張力分別干預(yù)HASMCS1、3、6小時后，ACE2活性沒有顯著改變12小時后，ACE2活性比靜態(tài)對照組明顯增加并達到峰值P＜001，而且這種增高趨勢持續(xù)到24H15％牽張力分別干預(yù)HASMCS1、3、6小時，對ACE2的活性均沒有顯著影響，干預(yù)12、24小時后，ACE2活性顯著降低P＜001。4牽張力對ANG17及ANGⅡ產(chǎn)生量的影響10％牽張力作用1H、3H、6H后，ANGⅡ、ANG17水平與靜態(tài)對照組相比未見明顯改變P＞00510％牽張力作用12H、24H后，與靜態(tài)對照組相比，ANGⅡ水平明顯降低P＜001，而ANG17水平明顯升高P＜005，P＜001。15％牽張力作用1H、3H后，ANGⅡ、ANG17水平比靜態(tài)對照組無明顯變化，15％牽張力作用6H后，其ANGⅡ水平比靜態(tài)對照組顯著增加P＜005，而ANG17水平較靜態(tài)組無顯著變化P＞005。15％牽張力作用12H、24H后，ANGⅡ水平比靜態(tài)對照組顯著升高P＜005，P＜001，而ANG17水平明顯降低P＜005，P＜001。5ACE2免疫熒光法檢測結(jié)果給予HASMCS10％周期性牽張力干預(yù)12小時，細胞免疫熒光進一步顯示與靜態(tài)培養(yǎng)相比，生理牽張力顯著上調(diào)ACE2蛋白表達水平。6ACE2在牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細胞生物學(xué)功能中的作用1采用BRDU摻入法結(jié)果提示10％牽張力能夠抑制HASMCS的增殖。2細胞劃痕實驗證明10％牽張力能夠抑制HASMCS的遷移。3轉(zhuǎn)染ACE2SIRNA48小時后ACE2表達水平顯著下調(diào)，與單純牽張力組比較，下調(diào)ACE2的表達能夠部分抵消10％牽張力抑制平滑肌細胞增殖、遷移的作用。7組織免疫熒光檢測結(jié)果實驗動物共20只，除1只死于手術(shù)前麻醉外，其余全部成活并順利完成實驗。組織免疫熒光結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，ACE2在結(jié)扎近心端的主動脈平滑肌細胞中表達明顯減低而在結(jié)扎遠心端的主動脈平滑肌細胞中表達沒有明顯改變WESTERNBLOT及實時定量PCR結(jié)果亦顯示主動脈弓結(jié)扎近心端ACE2蛋白及MRNA表達水平下調(diào)，而主動脈弓結(jié)扎遠心端血管段ACE2表達沒有變化。結(jié)論1生理性牽張力能夠持續(xù)上調(diào)平滑肌細胞中ACE2的表達，而病理性牽張力早期雖上調(diào)ACE2表達，但隨干預(yù)時間延長其表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。2ACE2參與生理牽張力對平滑肌細胞增殖、遷移的抑制作用3在主動脈弓結(jié)扎的小鼠中，與假手術(shù)組相比，異常的牽張力增加可以降低血管平滑肌細胞ACE2的表達。第二部分牽張力調(diào)控血管平滑肌細胞ACE2的分子機制研究由于血管一直暴露于血流動力學(xué)的作用下，異常的血液流體力學(xué)可作用于血管壁細胞導(dǎo)致動脈血管病變的發(fā)生、發(fā)展。我國高血壓患者已高達2億，高血壓病往往伴有周期性機械牽張力的增加，從而引起血管壁平滑肌細胞的形態(tài)和功能改變，進一步造成血管重構(gòu)，導(dǎo)致高血壓終末器官損害如心、腦血管疾病及高血壓腎病的發(fā)生、發(fā)展位于血管壁中層的平滑肌細胞的形態(tài)和功能異常在動脈血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。腎素血管緊張素RAS系統(tǒng)與心血管疾病密切相關(guān)，近年來，RAS系統(tǒng)新成員血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2ACE2對血管的保護作用受到了重視，ACE2在高血壓大鼠血管壁中、糖尿病心肌病和腎病以及心肌梗死動物模型中可以改善心臟及血管重構(gòu)。我們實驗室最近的研究證明在動脈粥樣硬化模型中ACE2過表達可延緩斑塊的發(fā)生發(fā)展，具有減少斑塊易損指數(shù)，穩(wěn)定斑塊的作用。機械牽張力可影響平滑肌細胞ANGⅡ的分泌，但是對于ACE2的作用尚不明了。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)與靜態(tài)對照組比較，生理牽張力10％ELONGATION，1HZ顯著上調(diào)血管平滑肌細胞ACE2的表達及活性，而過度增強的病理牽張力15％ELONGATION，1HZ卻下調(diào)血管平滑肌細胞ACE2的表達與活性，此外，我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)ACE2參與牽張力對平滑肌細胞增殖、遷移功能的調(diào)節(jié)作用。這些研究提示機械牽張力可能通過ACE2影響平滑肌細胞的功能和血管壁的重構(gòu)，但是牽張力調(diào)控ACE2的確切機制尚需進一步的深入研究。近年來關(guān)于牽張力調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能的分子機制研究取得了一定進展。盡管迄今尚未發(fā)現(xiàn)細胞表面存在特異的生物力學(xué)信號感受器，但位于胞膜表面的整合素、酪氨酸受體激酶、離子通道、小凹蛋白等結(jié)構(gòu)均可以將胞外的力學(xué)刺激傳導(dǎo)到胞內(nèi)，激活PKC、MAPK、PI3KAKT等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及活化AP1、NFΚB、EGR1、SP1等多種轉(zhuǎn)錄因子，最終通過改變細胞增殖、凋亡、表型分化等相關(guān)基因的表達而影響細胞功能。近年來，有關(guān)學(xué)者利用病毒載體或人工重組合成ACE2，在動物水平充分證明了ACE2的心血管保護作用，在體外水平上驗證了其對各種細胞生物學(xué)功能的影響。然而，各種病理生理刺激調(diào)控ACE2表達的分子機制目前還知之甚少。盡管有研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的平滑肌細胞中ANGⅡ可以通過激活ERK12信號通路抑制ACE2表達，但另一項研究卻發(fā)現(xiàn)在肝星狀細胞中，ANGⅡ上調(diào)ACE2的表達此外，研究表明過表達ACE2同樣可以抑制ACE、AT1R的表達，及ANGⅡ的分泌。以上充分說明了ACE2表達調(diào)控與RAS系統(tǒng)各組分之間關(guān)系的復(fù)雜性。既往有研究表明，高糖可以下調(diào)PKCΒⅡ的表達，后者可以下調(diào)SMCS中ACE2的表達及ANG17的生成牽張力可以激活MAPK、AKT、PKC信號通路，并活化AP1、NFΚB、SP1等轉(zhuǎn)錄因子，而ACE2啟動子序列中含有多個AP1、SP1結(jié)合位點。但是牽張力如何影響ACE2表達的機制目前尚未見文獻報道。目前在心血管領(lǐng)域，關(guān)于ACE2的研究大多數(shù)集中在對其下游功能的研究上，而對其自身表達調(diào)控知之甚少，牽張力通過什么信號通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞上ACE2的表達AP1、NFΚB是否參與牽張力調(diào)節(jié)ACE2表達這些問題都有待實驗進一步證實。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，深入研究生理性周期牽張力10％ELONGATION，1HZ調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞ACE2表達的分子機制，該研究將對動脈血管疾病的發(fā)生機制提供新的思路，對進一步理解RAS系統(tǒng)在維持血管功能與血管重塑中的作用與機制，尋找干預(yù)血管重構(gòu)相關(guān)疾病的新靶點，具有重要的現(xiàn)實意義。研究目的1明確生理牽張力對ACE2啟動子活性及MRNA穩(wěn)定性的影響2確定生理牽張力調(diào)節(jié)人平滑肌細胞ACE2表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子3明確生理牽張力調(diào)節(jié)人平滑肌細胞ACE2表達的主要信號通路。研究方法1人主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)及牽張力干預(yù)前期實驗購得人主動脈平滑肌細胞株HASMCSCIENCELL，采用SCIENCELL平滑肌細胞專用培養(yǎng)基SMCGS、2％FBS、1％PENICILLINSTREPTOMYCIN培養(yǎng)細胞，47代細胞用于實驗。接種平滑肌細胞HASMCS至鋪有Ⅰ型膠原的FLEXCELL六孔板中（105個細胞孔），待細胞生長達90％融合時，無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時，更換新的完全培養(yǎng)基，使用FLEXCELL5000TENSION細胞拉力儀給予細胞牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激。2細胞牽張力干預(yù)分組21、牽張力對ACE2MRNA穩(wěn)定性的影響1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。2牽張力干預(yù)組給予HASMCS牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激12小時。牽張力刺激12小時后，與靜止對照組一起，添加放線菌素D5UGML至細胞培養(yǎng)上清中，以抑制新的轉(zhuǎn)錄，分別用放線菌素D干預(yù)0、6、12小時，利用TRIZOL提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，利用實時熒光定量PCR檢測MRNA的表達，結(jié)果以不同時間點的MRNA水平與加入放線菌素D0小時的MRNA的比值來表示。觀察與靜態(tài)對照組相比較，生理牽張力是否增加平滑肌細胞ACE2MRNA的穩(wěn)定性。22、牽張力對ACE2啟動子活性的影響設(shè)計ACE2啟動子PCR擴增引物，PCR擴增、電泳后切膠，并行PCR產(chǎn)物回收，連接T載體和細胞轉(zhuǎn)化，構(gòu)建ACE2啟動子載體PGL3ACE2PROMOTER，利用INVITROGENLIP2000將啟動子載體與PRLTK載體共轉(zhuǎn)染平滑肌細胞24小時后，給予牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激3小時或靜止培養(yǎng)3小時，利用PROMEGA雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測牽張力10％ELONGATION，1HZ對ACE2啟動子活性的影響。23、確定介導(dǎo)生理牽張力10％ELONGATION，1HZ調(diào)節(jié)平滑肌細胞ACE2表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力干預(yù)15MIN、30MIN、1H、2H。3SN50組先給予HASMCSSN5018ΜM預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。4CURCUMIN組先給予HASMCSCURCUMIN10UM預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。5WP631組先給予HASMCSWP631100NM預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。WESTERNBLOT檢測P65、PP65、CFOS、PCFOS、CJUN、PCJUN、SP1、PSP1、ACE2蛋白表達實時熒光定量PCR檢測ACE2MRNA變化EMSA檢測NFΚ3、AP1的DNA結(jié)合能力24、MAPK信號通路在牽張力10％ELONGATION，1HZ調(diào)節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力刺激15MIN、30MIN、1H、2H。3PD98059組先給予HASMCSERK12抑制劑PD9805930UM預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6H。4SP600125組先給予HASMCSJNK12抑制劑SP600125（20ΜM）預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6H。5SB203580組先給予HASMCSP38抑制劑SB20358010ΜM預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6H。WESTERNBLOT檢測ERK12、PERK12、P38、PP38、JNK12、PJNK12、ACE2的蛋白表達實時熒光定量PCR檢測ACE2MRNA變化并檢測下游轉(zhuǎn)錄因子的活性。25、PKCⅡ信號通路在牽張力10％ELONGATION，1HZ調(diào)節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力刺激15MIN、30MIN、1H、2H。3CG53353組先給予HASMCSPKCΒⅡ抑制劑CG53353（100NM）預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6H。觀察PKCΒⅡ的磷酸化水平ACE2MRNA及蛋白表達水平下游轉(zhuǎn)錄因子的活性。26、AKT信號通路在牽張力10％ELONGATION，1HZ調(diào)節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預(yù)。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力刺激15MIN、30MIN、1H、2H。3LY294002組先給予HASMCSAKT抑制劑LY29400250ΜM預(yù)處理1小時，再給予牽張力刺激6H。觀察AKT、PAKT的表達ACE2MRNA、蛋白表達水平。3實驗方法應(yīng)用實時定量PCR法檢測ACE2MRNA的表達量用WESTERNBLOT技術(shù)檢測信號蛋白表達和磷酸化水平EMSA檢測AP1、NFΚB與DNA的結(jié)合活性。4統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示。使用SPSS160軟件中的單因素方差分析對結(jié)果進行分析，兩兩比較采用T檢驗。P＜005認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1牽張力對ACE2MRNA穩(wěn)定性無明顯影響給予HASMCS10％周期性牽張力干預(yù)12小時后，與放線菌

簡介：浙江大學(xué)博士學(xué)位論文敗血癥及臨床常見細菌16S23SRRNA基因區(qū)間的分子生物學(xué)研究姓名傅君芳申請學(xué)位級別博士專業(yè)兒科學(xué)指導(dǎo)教師洪文瀾200051不能通過水煮裂解而擴增。CHELEX100裂解法能一步裂解所研究的菌種，擴增條帶清晰，明亮，方法簡便陜速，污染機會少經(jīng)典的酚氯仿抽提細菌DNA進行PCR擴增，需將DNA在不同的管之間轉(zhuǎn)移，步驟繁瑣，增加污染機會最終確立CHELEX100裂解法為奉課題研究的細茵裂解方法。經(jīng)PCR擴增后，I3個菌種呈單一條帶，其中5種菌產(chǎn)單核李斯特氏茵、腦膜炎敗血黃桿菌、嗜水氣單胞茵、陰溝腸桿菌、類白喉棒狀桿菌能立刻區(qū)分，2種分枝桿菌具有與其它細菌不同的特異性條帶I800BP，還有6種菌不能區(qū)分；8個菌種呈兩條帶，其中3種茵肺炎鏈球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、福氏志賀氏茵能立刻區(qū)分。但嚆氏志賀氏茵與其它呈兩條帶的5種菌條帶相近，故在第二部分中亦對它們做了RFLP分析呈三條帶的三種菌糞腸球菌、洋蔥假單胞菌、枯草芽孢桿菌以及呈多條帶的7種菌B一溶血鏈球菌4條帶、大腸埃希氏菌4條帶、支氣管敗血鮑特氏菌4條帶、醋酸鈣不動桿菌5條帶，傷寒沙門氏菌5條帶、惡臭假單胞菌5條帶、痢疾志賀氏茵7條帶，它們的條帶分子量不同，互相之間能區(qū)分。從臨床分離的肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌等常見菌株共J5株，均呈現(xiàn)B標準菌株相同的DNA圖譜，表明這些條帶具有很好的重復(fù)性二葡萄球菌屬中11個不同菌種的16S23SRRNAF基因區(qū)間的研究＼萄萄球菌是引起兒童敗血癥的首位致病原，文獻報道葡萄球菌尤以金黃色葡萄球菌具有不同的RRNA基因區(qū)間PCR圖譜，且在葡萄球菌裂解I童程中，我們發(fā)現(xiàn)用水煮法及CHLEXLOO法均不能擴增葡萄球菌，因此為了研制簡便有效的裂解葡萄球菌的方法及詳細了解葡萄球菌屬細菌的16523SRRNA基因區(qū)問的PER圖譜，我們對葡萄球菌屬中II個不同菌種的75株細菌進行了研究。結(jié)果CHELEXL00裂解法經(jīng)改良后，即5％CHELEX緩沖液舍003％SDS，1％TWEEN20，1％NP40另加蛋白酶K，56“260MIN，煮沸15分鐘，取上清液便可成功擴增葡萄球菌。所有葡萄球菌除耳葡萄球菌外均具有共同條帶1200BP，600BP。且除金黃色葡萄球茵外，其它葡萄球菌只呈單一圖譜。28

簡介：第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文牙支抗羊下頜骨牽張成骨的組織學(xué)及分子生物學(xué)實驗研究姓名馮雪申請學(xué)位級別博士專業(yè)口腔醫(yī)學(xué)口腔正畸學(xué)指導(dǎo)教師林珠200051第四軍醫(yī)大學(xué)博士論文中文摘要侔張成骨技術(shù)DO在四肢骨中的應(yīng)用由來已久，但對于頜骨DO的實驗及臨床研究只有二十多年的歷史。由于四肢骨DO的原則不能完全適用于頜骨DO，所以有必要對此進行研究。目前國外對頜骨D0的研究主要是裝置的改進以及一些組織學(xué)研究，對于頜骨DO的分子生物學(xué)機制研究較少，而國內(nèi)這方面的研究報道更少。所以沐研究采用了自制的牙支抗裝置進行了山羊下頜骨的DO，觀察了裝置及山羊動物模型的可行性、牽引區(qū)內(nèi)的組織學(xué)變化規(guī)律、超微結(jié)構(gòu)改變、牽引過程中細胞周期的變化特點、信號分子的參與以及參與調(diào)節(jié)新骨形成的因子及蛋白的MRNA表達規(guī)律，以期深入了解DO過程，為進一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。F1牙支抗牽引下頒骨裝置的制作及山羊作為動物模型的可行性研究‘采用正畸常用材料自制了一種用牙支抗進行下頜骨DO的裝置，利用山羊作為動物模型，觀察了裝置的可靠性及山羊作為動物模型的可行性。結(jié)果表明，利用這一裝置能有效地進行下頜骨的DO，裝置在口內(nèi)固位良好，山羊?qū)β樽砑笆中g(shù)的耐受性好，性情溫馴，適于作為研究頜骨DO的動物實驗?zāi)Ｐ汀?牙支抗牽張成骨的組織學(xué)觀察及力學(xué)測定利用大體標本觀察、X線檢查、四環(huán)素熒光標記、HE染色、MALLORY三色染色及三點抗彎曲強度檢測等方法對再生的組織進行了組織學(xué)觀察及力學(xué)性能測定。結(jié)果表明，隨著牽引時間的延長，新骨在牽引區(qū)內(nèi)不斷生成、成熟。新骨的形成具有一定的特點從牽引區(qū)兩側(cè)向中間延伸、融合、改建，纖維束、新形成的骨小梁以及早期的各種細胞均表現(xiàn)為長軸與牽引力的方向一致。三點抗彎曲強度檢測結(jié)果表明，新骨的改建主要發(fā)生在固定期，隨著時間延長，其力學(xué)強度增加，但在實驗時間范圍內(nèi)，其強度仍較正常對照骨組織有明顯差別。3牽張成骨過程中組織超徽結(jié)構(gòu)變化的觀察通過透射電鏡技術(shù)觀察了新生組織的超微結(jié)構(gòu)變化特點，結(jié)果表明，

簡介：天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文CD44在前列腺癌細胞遷移、增殖中作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)的研究姓名崔衛(wèi)國申請學(xué)位級別博士專業(yè)外科學(xué)（泌尿外）指導(dǎo)教師徐勇20040501墨鲞墾型查蘭蔓主蘭墮墮塞作用進行了基本的探討。其中包括1．使用不同的PRESENILIN抑制劑觀察其對前列腺癌PC一3細胞遷移和增殖表型的不同影響。2．觀察過量表達包含不同結(jié)構(gòu)域的CD44分子對前列腺癌PC一3細胞遷移和增殖表型的不同影響。3．通過細胞組分分析和共聚焦顯微鏡直接觀察的方法研究CD44．ICD釋放后的亞細胞結(jié)構(gòu)定位。4．通過對常見轉(zhuǎn)錄因子報告基因和信號傳導(dǎo)通路的檢測，研究釋放并轉(zhuǎn)移進核后的CD44．ICD，可能的基因調(diào)控通路。5．通過RNA干涉和反義RNA技術(shù)消除CD44基因在前列腺癌PC．3細胞中的表達，進而考察下調(diào)CD44表達對腫瘤惡性表型的逆轉(zhuǎn)。另外，上述實驗中使用明膠酶譜分析、“劃痕”法和MATRIGEL包被的TRANSWELL法等檢測PC3細胞的遷移表型；使用MTT法檢測細胞存活和生長，TUNE／法檢測細胞的凋亡。結(jié)果1．前列腺癌PC一3細胞中檢測到CD44和PRESENILINL／2的表達。2．PRESENILIN抑制劑DAPT和DUPE下調(diào)PC一3細胞中MMP9的表達，抑制了PC．3細胞劃痕后的修復(fù)和在MATRIGEL中的侵襲但另一種PRESENILIN抑制劑JLK2沒有上述抑制細胞迂移的效應(yīng)。3．DAPT和DUPE處理的PC．3細胞存活率第3天開始下降，而且誘導(dǎo)細胞大量凋亡；JLK2處理的細胞存活正常，幾乎沒有凋亡。4．過表達CD44AE和CD44ICD的PC．3細胞遷移力明顯高于過表達CD44FL的細胞；過表達CD44FL、CD44AE和CD44ICD的PC一3細胞增殖率均有所升高，而且轉(zhuǎn)染CD44FL、CD44AE和CD44TCD并未誘導(dǎo)細胞的凋亡。5．DAPT和DUPE阻斷了CD44ICD從膜結(jié)合型CD44AE的水解釋放，JLX2沒有此種阻斷效應(yīng)。6．CD44ICD可以逆轉(zhuǎn)DAPT對PC一3細胞中MMP9的表達的抑制作用。7．CD441CD從膜結(jié)合型CD44AE的水解釋放后轉(zhuǎn)移進核，并可能通過調(diào)控NFRD3等轉(zhuǎn)錄因子影響其下游信號通路傳導(dǎo)。8．RNAI}I1反義RNA技術(shù)均可有效的消除內(nèi)、外源性CD44的表達。

簡介：研究意義致病性弧菌是一群氧化酶陽性、具有動力的革蘭陰性兼性厭氧菌，廣泛分布于海水、淡水、海產(chǎn)品中，尤以近?？?、河口多見，人類攝入或接觸污染的水源和食物易引起感染。致病性弧菌包含一大類共約12種弧菌，所致疾病的種類和毒性差別很大，其中最重要的，也是對人類、漁業(yè)影響最大的是O1型霍亂弧菌、非O1型霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌。近年來，致病性弧菌已成為夏秋季急性感染性腹瀉的重要、常見病原菌。大量研究表明，在我國江、河、湖、海各種水體中均有霍亂弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌存在，致病性的流行菌株通過污染海、水產(chǎn)品等引起人間疫情。大量研究結(jié)果表明我國各、地的幾乎每個省份，無論是咸、淡水及地表養(yǎng)殖水等水系中，還是海水產(chǎn)品，均可能有霍亂弧菌生長繁殖，且不同程度地存在流行株和產(chǎn)毒株，廣州市多次在黃沙水產(chǎn)市場、珠江內(nèi)外航道檢出霍亂弧菌；而副溶血弧菌更是嚴重污染水體和海水產(chǎn)品，有資料，我國華東沿海地區(qū)該菌的檢出率高達574％～665％，夏秋季更嚴重，成為造成食物中毒的嚴重隱患，同時由于美國和歐盟對進口水產(chǎn)品副溶血弧菌的強制檢驗，對我國水產(chǎn)品出口造成障礙。珠江河口地區(qū)水網(wǎng)豐富，為咸淡水交界，水質(zhì)、溫度很適宜霍亂等致病性弧菌生長。南沙是珠江入?？谥?，圍海造田形成19條河涌，較適宜養(yǎng)殖優(yōu)質(zhì)魚蝦蟹，水產(chǎn)品資源豐富。歷史上均曾發(fā)生過水型霍亂流行，九十年代一直有散發(fā)病例。在以往發(fā)生的食物中毒，已有多次證實為副溶血弧菌所致。2005年起，雖擴大了對水樣、海水產(chǎn)品中霍亂弧菌的監(jiān)測力度，但霍亂弧菌檢出率一直較低。與霍亂低發(fā)地區(qū)水體、海水產(chǎn)品的較高檢出率的結(jié)果有較大差異。且目前尚無對該地區(qū)以霍亂弧菌、副溶血弧菌為代表的致病性弧菌的分布特征、生態(tài)學(xué)進行研究的報道。因此，了解霍亂弧菌、副溶血弧菌在南沙河?？诘貐^(qū)的分布情況及其致病規(guī)律，掌握致病性弧菌的生態(tài)特征，對于預(yù)防該菌群感染，保障食品衛(wèi)生具有重要的現(xiàn)實意義。研究目的1掌握珠江河?？谒W(wǎng)地區(qū)霍亂弧菌、副溶血弧菌在不同方位、深度的水域及海水產(chǎn)品中的分布情況及其毒力基因攜帶特征2分析環(huán)境中霍亂弧菌與歷史病例分布的關(guān)系以及外環(huán)境中其它致病性弧菌的存在情況與腹瀉病人發(fā)生的關(guān)系。研究內(nèi)容1研究不同部位、季節(jié)水體的霍亂弧菌、副溶血弧菌的感染情況。2研究海水產(chǎn)品中的霍亂弧菌、副溶血弧菌的感染情況。3研究淤泥、土壤等外環(huán)境中的霍亂弧菌、副溶血弧菌的感染情況。5研究副溶血弧菌毒力基因耐熱直接溶血素TDH的攜帶情況；6研究外環(huán)境中的霍亂弧菌及與既往病例中檢出的霍亂弧菌的分子相關(guān)關(guān)系。材料與方法1樣品種類水體河涌水、海水及河涌淤泥、水生植物的樣品；甲殼類蝦、蟹、貝殼類蛤、牡蠣、貝殼及魚、蛙等海水產(chǎn)品；海水產(chǎn)品養(yǎng)殖水。2采樣時間水體及外環(huán)境采樣分別在漲潮、退潮時進行，海水產(chǎn)品及養(yǎng)殖水的采集在每月上旬完成。根據(jù)水文情況設(shè)計每次采樣時間。3采樣頻次與數(shù)量本研究采樣檢測為期一年。水樣采樣每月一次，每次共50份。養(yǎng)殖水樣每月檢測一次，每次10個海水產(chǎn)品每月檢測一次，每次計20份。4采樣方法按照相關(guān)技術(shù)規(guī)范實施。5霍亂弧菌培養(yǎng)分離鑒定按照GB159841995操作，副溶血性弧菌培養(yǎng)分離鑒定按照GBT47892003操作。采用PCR方法監(jiān)測霍亂弧菌、副溶血弧菌毒力基因攜帶情況；采用PFGE法對既往暴發(fā)疫情病例分離菌株與本研究環(huán)境分離霍亂菌株進行聚類分析。VP定量分析按照GBT47892003進行。結(jié)果1一般情況共采集了各類樣品840件，其中海水300份，河涌水樣300份，養(yǎng)殖水168份，淤泥、水草各180份，魚類96件、貝殼類72件、甲殼類48件、其他類蛙、24件。2共發(fā)現(xiàn)4宗霍亂弧菌污染的樣品，總陽性率為048％。4株霍亂弧菌均為O1群稻葉型，毒力基因監(jiān)測均為陰性，且均為非流行株。3PFGE聚類分析表明外環(huán)境分離菌株與2005年暴發(fā)疫情病例分離菌株集中表現(xiàn)為3種高度相近的PFGE型。環(huán)境分離菌株與病例分離菌株的相似度約842874％，而環(huán)境分離株之間相似都約874～982％。4本研究副溶血弧菌總陽性率為3625％；水產(chǎn)品的陽性率為4750％，水體總陽性率為2578％，淤泥和水草等環(huán)境樣本5111％。5海產(chǎn)品中，貝殼類水產(chǎn)品VP污染率最高6111％，其次為甲殼類5625％，其他類最低為3333％。陽性樣品平均密度以甲貝類最高，為19384MPN100G，其次為貝殼類181077MPN100G，魚類的陽性樣本平均密度最低，為124753％。6不同水體VP污染率表現(xiàn)為海水6330％河涌水4536％養(yǎng)殖水3829％，，陽性樣品平均密度卻表現(xiàn)為海水產(chǎn)品及環(huán)境20056±1346養(yǎng)殖水174578±2121河涌水148857±10222。7不同水體海產(chǎn)品VP污染率表現(xiàn)為海水產(chǎn)品6531％河涌水產(chǎn)品3919％養(yǎng)殖水產(chǎn)品3088％，陽性樣品平均密度卻表現(xiàn)出海水產(chǎn)品及環(huán)境194274±1536養(yǎng)殖水17045±987河涌水13087±1123。8海水、養(yǎng)殖水、河涌水的VP污染率均表現(xiàn)為深層3238％表層1975％。陽性樣品的平均密度也是深層水樣19216±974高于表層水樣。9海水退潮時VP污染情況3583％比漲潮2417％時嚴重，河涌水結(jié)果相似，退潮時VP污染情況3944％高于漲潮時1778％。10海產(chǎn)品、水體、淤泥與水草的VP污染率均表現(xiàn)為6～8月最高，而12～2月則陽性率較低，而且，陽性樣品平均密度也表現(xiàn)為6～8月最高。11本次調(diào)查水體的PH和鹽度范圍內(nèi)PH范圍在71～79；水體鹽度范圍為0～35％，海產(chǎn)品、海水、淤泥的VP污染率以及海產(chǎn)品、海水陽性樣品平均密度與水體PH和鹽度呈正相關(guān)關(guān)系。12對120株菌株進行VP毒力基因TDH檢測，從海產(chǎn)品來源菌株中檢出TDH陽性1株，淤泥來源菌株中檢出TDH陽性1株，其余均為TDH陰性。結(jié)論1、南沙珠江河口地區(qū)海產(chǎn)品、海水等外環(huán)境中存在霍亂弧菌，但檢出率較低；且均為非流行株，不攜帶毒力基因。2、外環(huán)境分離霍亂菌株之間，以及與既往暴發(fā)疫情病例分離菌株之間存在高度遺傳相關(guān)性。3、南沙珠江河口地區(qū)海產(chǎn)品、海水等外環(huán)境中副溶血弧菌污染嚴重，其中以貝殼類海產(chǎn)品為最高。海水及海水產(chǎn)品副溶血弧菌污染率高于其他環(huán)境水體。4、外環(huán)境副溶血弧菌檢出率與水體深度、潮汐、水溫、PH、鹽度等有關(guān)。5、南沙珠江河口地區(qū)海產(chǎn)品、海水等感染的副溶血弧菌大部分不攜帶毒力基因。