簡(jiǎn)介：目的幽門螺桿菌HPYLIHPSH0459蛋白由位于HPYLI可塑區(qū)TNPZ中的HPSH0459基因編碼，有研究認(rèn)為該基因的編碼產(chǎn)物可以與HPYLITNPZ中的其他基因VIRB4VIRB8VIRB9VIRB11，VIRD4和VIRD2編碼產(chǎn)物共同構(gòu)成一個(gè)新的Ⅳ型分泌系統(tǒng)TFS3A。目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏對(duì)HPSH0459基因及其編碼產(chǎn)物HPSH0459的功能及相關(guān)致病機(jī)制的研究報(bào)道。本文以HPYLI臨床分離菌株WH21為研究對(duì)象，通過(guò)分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)手段對(duì)HPSH0459基因及其編碼產(chǎn)物HPSH0459的功能進(jìn)行了探究，為深入研究其在HPYLI致病機(jī)制中的地位及作用奠定了基礎(chǔ)。方法1將HPYLIWH21菌株于微需氧環(huán)境中在KARMALI培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用PCR手段，以HPYLIWH21菌株基因組為模板，用特異性引物擴(kuò)增HPSH0459基因片段，經(jīng)測(cè)序后得到核酸序列，并推導(dǎo)出編碼氨基酸序列。采用生物信息學(xué)，分析HPSH0459基因推導(dǎo)蛋白的基本理化性質(zhì)、細(xì)胞定位、信號(hào)肽及空間結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息2構(gòu)建HPSH0459基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至ECOLIROSETTADE3中，以IPTG誘導(dǎo)宿主表達(dá)融合蛋白HPSH0459。用NI2NTA親和層析柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，并采用WESTERNBLOT對(duì)其所攜帶的HIS標(biāo)簽進(jìn)行鑒定。以純化后的HPSH0459為抗原，通過(guò)免疫家兔制備抗HPSH0459多克隆抗體，抗體效價(jià)通過(guò)ELISA方法測(cè)定3將不同濃度的純化HPSH0459蛋白與人正常胃上皮細(xì)胞GES1進(jìn)行共培養(yǎng)，用MTT方法研究其細(xì)胞毒性。將共培養(yǎng)后的上清培養(yǎng)液收集，用IL8檢測(cè)試劑盒ELISA法檢測(cè)其中的IL8含量4采用低溫超速離心法將HPYLIWH21菌株的菌體成分裂解為不同的亞細(xì)胞組分，以兔抗HPSH0459多克隆抗體為一抗，以免疫印跡法對(duì)HPSH0459的亞細(xì)胞定位進(jìn)行檢測(cè)。用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的手段，探究HPSH0459的互作蛋白5構(gòu)建HPSH0459基因敲除載體，用于建立HPSH0459的基因缺失株。結(jié)果1以HPYLIWH21菌株為模板，成功獲得了長(zhǎng)度為1233BP的HPSH0459基因全長(zhǎng)片段。生物信息學(xué)分析顯示，該基因可編碼分子量為4631KDA的蛋白質(zhì)，該蛋白由411個(gè)氨基組成。該蛋白的等電點(diǎn)為945，屬于無(wú)信號(hào)肽的親水性穩(wěn)定蛋白，其抗原位點(diǎn)聚集于C端，空間結(jié)構(gòu)呈通道狀，提示HPSH0459蛋白可能參與細(xì)胞生物大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。2構(gòu)建了HPSH0459基因的原核表達(dá)載體PET28AHPSH0459633BP，經(jīng)誘導(dǎo)純化后獲得了高純度的HPSH0459的C端蛋白。通過(guò)免疫家兔，獲得了效價(jià)為1∶32，000的兔抗HPSH0459多克隆抗體。3HPSH0459蛋白與GES1共培養(yǎng)后，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和ELISA法對(duì)HPSH0459蛋白的細(xì)胞毒性和上清液IL8含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明HPSH0459蛋白的細(xì)胞毒性有濃度依賴性，HPSH0459濃度為01ΜGML時(shí)的細(xì)胞抑制率明顯低于HPSH0459濃度為20ΜGML時(shí)的細(xì)胞抑制率（302％±002％VS5757％±003％，P＜001）。隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，24H131631±21278PGML和12H104344±21088PGML的IL8水平明顯高于共培養(yǎng)6H的IL8水平9722±1147PGML，P＜001。表明該蛋白能明顯刺激細(xì)胞IL8的分泌，與宿主炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。4以兔抗HPSH0459多克隆抗體為一抗，分別采用免疫印跡法和免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法明確了HPSH0459蛋白的亞細(xì)胞定位及互作蛋白。結(jié)果表明，HPSH0459定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞周質(zhì)上，與鋅指蛋白和蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白等存在相互作用。5成功構(gòu)建了HPSH0459基因的敲除載體PBLUEKM40△HPSH0459∷KAN。結(jié)論1通過(guò)信息分析，明確了HPSH0459是一種高親水性的穩(wěn)定性蛋白，有較強(qiáng)的抗原性，該蛋白與VIRB10、TRBI家族蛋白具有較高的同源性。其空間結(jié)構(gòu)呈中空的通道狀，可能與周邊的其他VIRB基因組成一個(gè)新的T4SS。2通過(guò)構(gòu)建HPSH0459原核表達(dá)載體PET28AHPSH0459633BP，獲得了目的蛋白和高效價(jià)的兔源HPSH0459多克隆抗體。3明確了該蛋白與鋅指蛋白和蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白等蛋白存在相互作用，可能與HPYLI的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。4明確了HPSH0459是一種定位于細(xì)菌細(xì)胞膜和膜周質(zhì)中的有濃度依賴性細(xì)胞毒作用的蛋白。能刺激細(xì)胞IL8的分泌，與組織炎癥的發(fā)生有關(guān)5成功構(gòu)建了HPSH0459基因敲除載體PBLUEKM40△HPSH0459∷KAN。

簡(jiǎn)介：獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲侵眥或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名簽字日期≯／∥年J月夕／日簽字日期≯／D年J月∥日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解易似、、有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授褪犧以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者簽名簽字日期洲移年學(xué)位論文作者畢業(yè)去向工作單位通訊地址導(dǎo)師簽名簽字日期電話郵編月／日三苯胺基衍生物化學(xué)熒光探針的合成、構(gòu)效關(guān)系及生物學(xué)應(yīng)用研究二乙氨基基團(tuán)得到的，而L2則是通過(guò)螯合作用對(duì)ZN2有著很強(qiáng)的選擇性識(shí)別。我們利用紫外光譜、熒光光譜、質(zhì)譜及核磁共振譜分別對(duì)L1和L2不同的識(shí)別機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。對(duì)ZN2的選擇性識(shí)別，L2被選作細(xì)胞內(nèi)和活體組織中鋅離子的探測(cè)器，這些體外，體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針L2可以檢測(cè)活細(xì)胞和活體組織中鋅離子的含量及其分布情況。3、以三苯胺基為給體中心，通過(guò)C_N及苯并乙烯橋連，引入羥苯基等末端基團(tuán)合成三苯胺基希夫堿衍生物L(fēng)WL，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中控制鈀碳、水合肼的量及反應(yīng)時(shí)間，可以將橋連基團(tuán)苯并乙烯基還原成苯并乙基，得到非共軛的三苯胺基希夫堿衍生物L(fēng)W2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在甲醇溶劑中，結(jié)構(gòu)類似的三苯胺基希夫堿熒光探針LWL和LW2均對(duì)鋁離子都表現(xiàn)出明顯的熒光增強(qiáng)性選擇性識(shí)別，但究其機(jī)理卻完全不同。帶有雙鍵的希夫堿探針LWL的識(shí)別機(jī)理是鋁離子的加入促進(jìn)其分解成胺基化合物，胺基化合物對(duì)鋁離子進(jìn)行特異性識(shí)別。而帶有單鍵的希夫堿LW2的識(shí)別機(jī)理卻是直接通過(guò)螯合作用來(lái)特異性識(shí)別鋁離子。關(guān)鍵詞三苯胺衍生物；熒光探針識(shí)別機(jī)理；光致變色；生物成像Ⅱ

簡(jiǎn)介：IIIIIIIIIIIIU11111LY3404742學(xué)校代碼學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)柮芗?jí)鄭州大孚專業(yè)碩士學(xué)位論文長(zhǎng)鏈非編碼RNABCYRN1在食管鱗癌中的表達(dá)水平及其生物學(xué)功能的研究作者導(dǎo)師學(xué)科專業(yè)培養(yǎng)完成姓名劉青青姓名郭長(zhǎng)青教授門類醫(yī)學(xué)名稱內(nèi)科學(xué)消化內(nèi)科院系鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院時(shí)間2018年5月原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者糾青青日期20廖年J月以日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。學(xué)位論文作者杏J稍日期洲彥年』月歹歹目

簡(jiǎn)介：◆●碩士學(xué)位論文七帶石斑魚(yú)繁育生物學(xué)與波紋唇魚(yú)組題目織學(xué)的研究STUDIESONBREEDINGBIOLOGYOFEPINEPHELUS英文題目SEPTEMFASCIATUSANDHISTOLOGICBIOLOGYOFCHEILINUS以廳DU／ATUS專業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖研究方向繁育與基礎(chǔ)生物學(xué)姓名廖光勇指導(dǎo)教師區(qū)又君研究員上海海洋大學(xué)，上海201306中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州510300二O年六月●●上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫(xiě)，我對(duì)所寫(xiě)的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文日期沙T’上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密口，在年解密后適用本版權(quán)書(shū)?！霰緦W(xué)位論文屬學(xué)位論文作者日期O，、年指導(dǎo)教師簽名吾哭芳日期知11年∥月／OEI

簡(jiǎn)介：西南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文中等衛(wèi)校微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)課程教學(xué)中學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)姓名陳列申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)學(xué)科教學(xué)生物指導(dǎo)教師張耀光陳林光20040601ONTHETRAININGOFSTUDENTS’INNOVATIVECOMPETENCESINTHECOURSEOFMICROBIOLOGY＆TESTINGTECHNOLOGYMTTFORSECONDARYSANITATIONTECHNICALSCHOOLSSSTSMAJORBIOLOGYTEACHINGRESEARCHORENTATIONBIOLOGYPEDAGOGYTUTORSPROFESSORZHANGYAOGUANG，PROFESSORCHENLINGUANGAUTHORCHENLIEJ200036ABSTRACTTHECOMPETENCESOFINNOVATION，WHICHNEEDSSOMEKNOWLEDGEINFACT，ISAKINDOFINTELLECTUALACTIVITYASWELLASAMENTALINCLINATIONEXPLORINGTHEPROBLEMSACTIVELYANDPOSITIVELY，ALSOAKINDOFUNIVERSALPOTENTIALWHICHPEOPLEHAVEHOWEVER，THEPOTENTIALTRANSFORMISDEPENDINGONTHEEFFICIENTEDUCATIONTHEREARENOFORMED，STEADYANDSPECIFICPROJECTSANDMEASURESFORTHETRAININGOFINNOVATIVECOMPETENCESTHESUBJECTTEACHINGISAMAINCHANNELFOREDUCATIONTHEESSENTIALWAYTOTRAINTHESTUDENTS’INNOVATIVECOMPETENCESISTOREALIZEJNNOVATIONOFTEACHINGSUBJECTSACCORDINGTOTHECOGNITION，THISDISSEI’TATIONPRESENTSSUCHAPROPOSITIONTRAININGSTUDENTS’INNOVATIVECOMPETCNCESTHROUGHTHECOURSEOFMTT，ANDTHEAUTHORHASBEENDEMONSTRATINGTHEPROBABILITIESANDESSENTIALITIESOFSTUDENTS’INNOVATIONABILITIESTRAININGANDALSOPROPOSINGSOMENEWIDEASINTHESTUDYTHEDISSERTATIONFOCUSESONBOWTOINNOVATETEACHINGTHECOURSEOFMTTTOADAPTTOTHENEEDSOFTRAININGSTUDENTS’INNOVATIONINORDERTOKEEPUPWITHTHEPACEOFTHEEDUCATIONALREFORMANDDEVELOPMENTINSSTS，ANDMEETTHECHANGESOFTHESPECIALIZEDCOURSESOBJECTIVES，CHARACTERSANDMEDICALEDUCATIONALMODELS，THESTUDENTS’INNOVATIONCOMPETENCESMUSTBETRAINEDNOWADAYSATTHESAMETIME，THEPHYSICALANDMENTALCHARACTERSOFTHESTUDENT’SMAJOREDINTESTING2

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)研究分析脾氣虛證和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌、心肌線粒體能量代謝，探討中醫(yī)脾虛證候與線粒體功能的關(guān)系；并闡明脾氣虛證與脾不統(tǒng)血證大鼠兩種證候的實(shí)質(zhì)及其線粒體能量代謝差異的機(jī)理。方法1脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠模型的構(gòu)建將SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為四組，正常對(duì)照組，低分子肝素鈉對(duì)照組，脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組。采用游泳疲勞加飲食失節(jié)法處理脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠，構(gòu)建脾氣虛證大鼠模型。成功后，在維持上述處理因素的基礎(chǔ)上，對(duì)脾不統(tǒng)血組大鼠皮下注射低分子肝素鈉處理，構(gòu)建脾不統(tǒng)血證大鼠模型。記錄大鼠體征和行為變化，并檢測(cè)其生理代謝變化。2測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠組織ATP含量，分析脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌、心肌能量代謝情況。3檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物（COMPLEXⅠ、COMPLEXⅡ、COMPLEXⅢ、COMPLEXⅣ）的活性。4檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織線粒體檸檬酸合酶（CS）的活性。5測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠線粒體DNA拷貝數(shù)，分析脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌、心肌線粒體變化。6提取實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WESTERNBLOT）檢測(cè)COXIV蛋白和CYTC蛋白表達(dá)量的變化。7采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌、心肌組織中COXIV蛋白和CYTC蛋白的MRNA表達(dá)量變化。結(jié)果1造模處理42天后，成功構(gòu)建脾氣虛證大鼠模型，75天后，成功構(gòu)建脾不統(tǒng)血證大鼠模型，為研究脾虛證和線粒體的關(guān)系立下基礎(chǔ)。2脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌ATP含量較正常大鼠均顯著性降低，并且二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。末期脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌ATP含量較正常大鼠均顯著性降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性較正常大鼠均顯著降低，且二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。末期脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性較正常大鼠均顯著降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌檸檬酸合酶活性較正常大鼠均顯著性降低，且二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌檸檬酸合酶活性較正常大鼠均顯著性降低，且二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌線粒體DNA（MTDNA）拷貝數(shù)較正常大鼠均顯著性降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在心肌中，脾不統(tǒng)血證大鼠MTDNA拷貝數(shù)較正常大鼠顯著性升高，脾氣虛組大鼠MTDNA雖略顯升高，但與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與脾不統(tǒng)血組大鼠相比也沒(méi)有顯著性差異。6脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌COXIV蛋白表達(dá)量較正常大鼠均顯著降低，CYTC蛋白表達(dá)量均顯著升高，但兩組大鼠骨骼肌的這兩種蛋白表達(dá)量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。末期脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌COXIV蛋白表達(dá)量較正常大鼠均顯著性降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；脾氣虛組中期大鼠的心肌CYTC蛋白表達(dá)量較正常大鼠顯著性降低，脾不統(tǒng)血組末期大鼠的心肌CYTC蛋白表達(dá)量則顯著升高。7脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的骨骼肌COXIV蛋白的MRNA表達(dá)量較正常大鼠均顯著性降低，CYTC蛋白的MRNA表達(dá)量均顯著性升高，但兩組大鼠這兩種蛋白的MRNA表達(dá)量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脾氣虛證大鼠和脾不統(tǒng)血證大鼠的心肌COXIV蛋白的MRNA表達(dá)量較正常大鼠顯著性降低，但二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；脾氣虛組中期大鼠心肌CYTC蛋白的MRNA表達(dá)量較正常大鼠顯著性降低，脾不統(tǒng)血組末期大鼠心肌CYTC蛋白的MRNA表達(dá)量則顯著性升高。結(jié)論1中醫(yī)脾虛病證與線粒體能量代謝障礙互為因果關(guān)系。2脾虛證大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性及檸檬酸合酶活性的降低，是其組織ATP含量降低的重要原因。3脾虛證線粒體能量代謝障礙涉及線粒體DNA拷貝數(shù)的變化與COXIV蛋白和CYTC蛋白及其MRNA表達(dá)量的改變。4脾虛證大鼠表現(xiàn)出骨骼肌和心肌線粒體能量代謝障礙，符合了中醫(yī)脾主肌肉的理論。5脾不統(tǒng)血證與脾氣虛證線粒體能量代謝障礙程度的不同，是兩種病證差異的重要機(jī)理。

簡(jiǎn)介：沙眼衣原體（CHLAMYDIATRACHOMATIS，CT）生殖道感染日趨嚴(yán)峻，目前仍缺乏有效疫苗。亞單位疫苗是衣原體疫苗發(fā)展的必然趨勢(shì)，但單一亞單位疫苗很難在CT粘附、侵入、增殖、釋放等各階段發(fā)揮作用，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)和鑒定更多有效的CT亞單位疫苗候選抗原，構(gòu)建含有多種抗原分子、多價(jià)聯(lián)合的亞單位疫苗并在佐劑、免疫接種途徑等方面進(jìn)行優(yōu)化是CT疫苗研究的優(yōu)選策略。本研究采用CT小鼠生殖道感染模型對(duì)課題組前期發(fā)現(xiàn)的5個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)抗原進(jìn)行保護(hù)性評(píng)價(jià)，篩選有效的亞單位疫苗候選抗原；對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)粒編碼蛋白PGP3的保護(hù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，判斷其作為亞單位疫苗候選抗原的可行性并比較不同接種途徑對(duì)其保護(hù)性的影響；應(yīng)用“高通量融合蛋白微陣列”技術(shù)，全基因組篩選CT感染依賴性抗原，為亞單位疫苗候選抗原提供更多的備選分子。衣原體致病機(jī)制不清是阻礙疫苗成功研制的重要因素。衣原體嚴(yán)格胞內(nèi)寄生，在感染細(xì)胞的包涵體內(nèi)常有糖原合成，糖原累積障礙則CT的致病能力隨之消失，因此，研究CT糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)的定位及生物學(xué)特性，對(duì)闡明CT糖原代謝途徑及致病機(jī)制具有重要意義，并可能對(duì)CT疫苗設(shè)計(jì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。一、CT免疫優(yōu)勢(shì)抗原的保護(hù)性評(píng)價(jià)及感染依賴性抗原的篩選研究目的1對(duì)課題組前期鑒定的5個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)抗原（ARTJ，OMCB，MIP，INC，HP）進(jìn)行動(dòng)物免疫后的保護(hù)性評(píng)價(jià)，為人類衣原體亞單位疫苗研制提供候選抗原及參考信息。2探討衣原體強(qiáng)免疫原性的質(zhì)粒編碼蛋白PGP3是否具有亞單位疫苗的保護(hù)作用，并比較PGP3蛋白不同免疫接種途徑對(duì)保護(hù)性效果的影響。3全基因組范圍篩選沙眼衣原體免疫優(yōu)勢(shì)的感染依賴性抗原，為CT致病機(jī)制研究及疫苗防治提供新靶標(biāo)。研究方法1利用PGEX6P載體，原核克隆表達(dá)并純化MOPN的5個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)抗原（ARTJ，OMCB，MIP，INC，HP），與弗氏不完全佐劑IFA及新型佐劑CPG寡脫氧核苷酸混勻后肌肉接種免疫BALBC小鼠，再采用MOPNEB陰道感染小鼠，間接免疫熒光法檢測(cè)抗原免疫對(duì)小鼠下生殖道衣原體清除率的影響，肉眼和組織病理學(xué)染色觀察上生殖道組織的炎癥和水腫情況，ELISA法檢測(cè)特異性抗體滴度及細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。2利用PGEX6P載體，原核克隆表達(dá)并純化PGP3蛋白，分別與佐劑CPG或和IFA混勻后，經(jīng)滴鼻或肌注途徑免疫BALBC小鼠，再采用MOPNEB陰道感染小鼠，比較PGP3蛋白不同接種方式對(duì)小鼠下生殖道衣原體清除率和上生殖道病變的影響；比較兩種接種方式誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有何不同。3制備大量高純度的CTD型活EB及經(jīng)紫外線滅活的UVEB，將低劑量活EB以滴鼻感染的方式免疫一組C3HHEJ小鼠，將高劑量UVEB與佐劑混勻后以肌肉接種的方式免疫另一組小鼠，分別收獲兩組小鼠的血清，與CTD型全基因組編碼的“高通量融合蛋白微陣列”進(jìn)行ELISA反應(yīng)，篩選僅被活EB滴鼻感染組小鼠血清優(yōu)勢(shì)識(shí)別的感染依賴性抗原，并檢測(cè)這些抗原刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的情況。研究結(jié)果1以MOPN基因組DNA為模板，制備了5種較高純度的衣原體重組蛋白，肌肉接種免疫小鼠后，僅MIP蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為下生殖道脫落上皮細(xì)胞中的衣原體含量顯著減少，清除速率加快；上生殖道的輸卵管積水程度和炎癥反應(yīng)減輕，發(fā)病率下降。MIP免疫能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體和高水平的TH1型細(xì)胞因子IFNΓ。2PGP3蛋白滴鼻或肌肉注射方式免疫小鼠，均能增強(qiáng)小鼠對(duì)衣原體下生殖道感染的抵抗力，但滴鼻組小鼠陰道脫落上皮細(xì)胞中MOPN帶菌量在感染后12D與對(duì)照組比較即有顯著性差異，而肌肉組這種差異要到感染后21D才出現(xiàn)；感染后60D僅滴鼻組小鼠輸卵管積水發(fā)病率、炎癥和水腫程度顯著低于對(duì)照組，P3PGP3蛋白滴鼻免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的IGG亞類中IGG2A與IGG1的比值、下生殖道分泌物中IGA的含量均顯著高于PGP3蛋白肌肉免疫組；兩種方式免疫后的小鼠脾細(xì)胞，在體外受到PGP3蛋白的再次刺激時(shí)，滴鼻組較肌注組產(chǎn)生更高水平的IFNΓ和更低水平的IL17。4CT低劑量活EB以滴鼻感染的方式或高劑量UVEB以肌肉接種的方式免疫兩組C3HHEJ小鼠后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)兩組之間無(wú)顯著性差異（P＝056）；CT全基因組908個(gè)FS編碼的抗原，僅有60個(gè)抗原可被至少一份血清識(shí)別，其中30個(gè)抗原只被活EB滴鼻感染組小鼠血清識(shí)別；有12個(gè)抗原被兩組血清同時(shí)識(shí)別且各組的識(shí)別率均≥50％，1個(gè)抗原CT875僅被UVEB肌肉免疫組小鼠血清識(shí)別且識(shí)別率≥50，5個(gè)抗原只被活EB滴鼻感染組小鼠血清識(shí)別且識(shí)別率≥50。5識(shí)別頻率≥40的9種感染依賴性抗原，有7種刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFNΓ與對(duì)照組比較顯著升高（P結(jié)論1被評(píng)估的5種免疫優(yōu)勢(shì)抗原，僅MIP蛋白免疫可誘導(dǎo)小鼠抵抗MOPN的生殖道感染，其免疫保護(hù)機(jī)制可能與誘導(dǎo)產(chǎn)生TH1型為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)。2PGP3蛋白滴鼻免疫較肌肉免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的TH1型免疫應(yīng)答，滴鼻方式能誘導(dǎo)小鼠抵抗MOPN的生殖道感染。3CTD型活EB滴鼻感染方式免疫或UVEB肌注方式免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體效價(jià)無(wú)差異，但有30個(gè)CTD型基因組編碼的抗原僅被活EB滴鼻感染組小鼠產(chǎn)生的血清抗體識(shí)別，為篩選出來(lái)的感染依賴性抗原。4PCT03PGP3，CT823，CT806，CT148，CT039，CT315這6種感染依賴性抗原主要刺激小鼠產(chǎn)生CD4TH1型為主、TH17型減低的細(xì)胞免疫應(yīng)答。二、CT糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)的定位及GLGA蛋白的生物學(xué)特性研究研究目的1對(duì)CT6個(gè)糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)在衣原體感染細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行定位分析，為研究CT的糖原代謝途徑提供有力的實(shí)驗(yàn)工具和數(shù)據(jù)。2研究CT糖原合酶GLGA蛋白的分泌特點(diǎn)及對(duì)細(xì)胞糖原濃度和衣原體感染的影響，分析人類CT自然感染情況下GLGA蛋白的免疫原性，為深入探討GLGA蛋白的功能及在衣原體致病機(jī)制中的作用打下基礎(chǔ)。研究方法1從CTD型基因組獲取糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)的編碼基因CT042GLGX，CT087MALQ，CT248GLGPCT295MRSA，CT489GLGC，CT798GLGA，原核克隆表達(dá)并純化后免疫小鼠制備相應(yīng)的多克隆抗體，間接免疫熒光法檢測(cè)其在CT感染細(xì)胞的定位；抗體稀釋法、免疫熒光共聚焦顯微鏡、GST融合蛋白吸附實(shí)驗(yàn)及WESTERNBLOT技術(shù)等分析GLGA多克隆抗體的特異性及GLGA蛋白胞漿分泌現(xiàn)象的真實(shí)性。2分段提取衣原體感染細(xì)胞的各種成分，WESTERNBLOT分析GLGA蛋白在衣原體感染細(xì)胞各成分的分布；間接免疫熒光染色法比較GLGA與CPAF蛋白分泌時(shí)相及分泌程度上的差異，研究GLGA蛋白分泌現(xiàn)象在沙眼衣原體各生物型或血清型的普遍性；構(gòu)建PGLAGGLGA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞，研究GLGA蛋白的生物學(xué)活性，分析PFLAGGLGA轉(zhuǎn)染對(duì)衣原體感染率的影響；收集CT泌尿生殖道急性和慢性感染的病人血清分析人類衣原體自然感染情況下GLGA蛋白的免疫原性。研究結(jié)果1CT6種糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)均具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體；用6種多抗對(duì)CT體外感染的HELA細(xì)胞進(jìn)行染色，僅GLGA抗體可在衣原體菌體外檢測(cè)到抗原信號(hào)，稀釋GLGA抗體僅降低染色的強(qiáng)度，不影響染色信號(hào)的分布；共聚焦顯微鏡下，CT菌體抗原主要外膜蛋白MOMP與另一種菌體抗原HSP60的染色信號(hào)完全重疊，而GLGA抗原與MOMP僅部分重疊，在包涵體內(nèi)菌體的間隙之間以及宿主細(xì)胞胞漿均有GLGA抗原分布。2GLGA抗體對(duì)CT感染細(xì)胞的染色僅能被GSTGLGA融合蛋白移除，GSTCPAF或GSTPGP3融合蛋白的預(yù)吸附對(duì)GLGA抗體的染色沒(méi)有影響，反之亦然；在WESTERNBLOT的檢測(cè)中，3種分泌蛋白GLGA、CPAF和PGP3的相應(yīng)抗體也只識(shí)別相應(yīng)的內(nèi)源性抗原及各自的GST融合蛋白。3GLGA抗原在衣原體感染細(xì)胞的胞漿、包涵體、EB、RB廣泛分布，與CPAF僅分布與感染細(xì)胞胞漿的存在模式明顯不同；GLGA蛋白在衣原體感染細(xì)胞后12H開(kāi)始表達(dá)于包涵體，感染后24H分泌到宿主細(xì)胞胞漿，同時(shí)在包涵體內(nèi)仍有分布，并一直持續(xù)到感染結(jié)束；GLGA蛋白在CT體外感染細(xì)胞的分布率與CPAF一致，其分泌現(xiàn)象普遍存在于CT各生物型血清型。4外源PFLAGCMV4GLGA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞后，能顯著提高細(xì)胞的糖原濃度但不影響細(xì)胞對(duì)衣原體的感染；GLGA蛋白能被生殖道CT感染的女性患者血清識(shí)別，其中STI患者（CT急性感染）的識(shí)別率為60，TFI患者（CT慢性感染）的識(shí)別率為29，兩組之間有顯著性差異；其它3種分泌性蛋白CPAF、PGP3、CT795被STI或TFI血清識(shí)別率為100、95、35或92、96、50，兩組無(wú)明顯差異。結(jié)論1首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)CT糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)CT798糖原合酶，GLGA是一種胞漿分泌蛋白，與CT其它兩種分泌蛋白CPAF和PGP3之間無(wú)交叉反應(yīng)。2CT其它5種糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)CT042GLGX，CT087MALQ，CT248GLGP，CT295MRSA，CT489GLGC均定位于衣原體菌體。3糖原合酶GLGA蛋白的分泌特性與胞漿分泌蛋白CPAF相似但不完全相同，外源性表達(dá)GLGA蛋白顯著升高細(xì)胞糖原濃度，但不影響細(xì)胞對(duì)CT感染的敏感性。6GLGA蛋白較其它糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)的免疫原性強(qiáng)，被CT急性或慢性生殖道感染患者血清的識(shí)別頻率有顯著性差異，可能與其它CT相關(guān)抗原聯(lián)合開(kāi)發(fā)為衣原體急性感染的診斷標(biāo)志。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文密級(jí)瀾滄江絲尾鯪生物學(xué)和資源BIOLOGYANDIESOLIICESOFMYSTUSNUNERUSINTHELANCANGRIVER研究生陰雙雨指導(dǎo)教師陳大慶研究員指導(dǎo)小組劉紹平研究員段辛斌副研究員劉明典博士王珂助理研究員李志華助理研究員專業(yè)漁業(yè)資源獲得學(xué)位名稱農(nóng)學(xué)碩士研究方向魚(yú)類生態(tài)獲得學(xué)位時(shí)間2011年6月日華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院二。一一年六月IFLLIIIIILLUIIIIFLLLY2004184華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書(shū)學(xué)位論文否如需保密，解密時(shí)間年月日是否保密獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所里交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)豹學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行7審定。與我一同工作的同志對(duì)本研究所傲的任何貢獻(xiàn)均已在論文中傲7瞬確的說(shuō)魄。并表示7謝意研究生簽名聲月雙I蘺時(shí)間刎F年‘月≥蜀學(xué)位論文使用授權(quán)書(shū)本人完全了解華中農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于保存，使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)生必須按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印尉本和電子版本學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印尉版和電子版并提供目錄檢索和閱覽服務(wù)。可以采用影印縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本人同意華中農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容同時(shí)本人保留在其他媒體發(fā)表論文的權(quán)力。注保密學(xué)位論文即涉及技術(shù)秘密、商業(yè)秘賽或申請(qǐng)專利等潛在需要提交保密的論文在解密后螽用于本授權(quán)書(shū)。學(xué)位做作者簽名搬兩導(dǎo)師簽名愀簽名日期201F年‘月Z目簽名日期2011年占月2目

簡(jiǎn)介：目的合成NOTADGL及NOTADGLPEGRGDYC兩種前體，分別對(duì)其進(jìn)行正電子放射性標(biāo)記及體內(nèi)外生物學(xué)評(píng)價(jià)。方法1前體的合成。①NOTADGL的制備DGL與NOTANHS溶于在DMSO溶液中室溫下避光反應(yīng)24H。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行氨基乙酰化反應(yīng)，最后用醋酸鈉緩沖液進(jìn)行透析。②NOTADGLPEGRGDYC的制備NHSPEGMAL與RGDYC在醋酸鈉緩沖液中室溫下避光反應(yīng)5MIN，反應(yīng)結(jié)束后加入DGL，再加入硼酸緩沖液繼續(xù)反應(yīng)24H。反應(yīng)結(jié)束后，加入過(guò)量Β巰基乙醇。NOTANHS溶于DMSO溶液，繼續(xù)室溫下避光反應(yīng)24H，最后用醋酸鈉緩沖液進(jìn)行透析。2顯像劑的制備。用鹽酸從鍺鎵發(fā)生器中淋洗出68GACL3，與前體在70℃下避光反應(yīng)10～15MIN。3脂水分配系數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。4體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。5細(xì)胞攝取及洗脫實(shí)驗(yàn)。6體內(nèi)生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn)。①正常小鼠的體內(nèi)生物學(xué)分布。②荷瘤鼠的體內(nèi)生物學(xué)分布。7荷瘤鼠的MICROPET顯像。8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS200進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜005具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1標(biāo)記前體NOTADGL及NOTADGLPEGRGDYC的合成表征。①通過(guò)核磁氫譜證明PEG及RGDYC成功連接到DGL上，得到DGLPEGRGDYC。②通過(guò)紫外吸光度檢測(cè)證明NOTANHS成功連接到DGL上得到標(biāo)記前體NOTADGL及NOTADGLPEGRGDYC。2放射性標(biāo)記及質(zhì)量控制。顯像劑可在15MIN內(nèi)可制得，放化產(chǎn)率在50％70之間，分離純化后其放化純度均＞98。PH值介于40～42之間為無(wú)色、透明、澄清的溶液，無(wú)其他重金屬污染。3脂水分配系數(shù)測(cè)定。經(jīng)測(cè)定68GANOTADGL的LOGP162，68GANOTADGLPEGRGDYC的LOGP3037，表明兩種納米分子探針均呈水溶性。4體外穩(wěn)定性。68GANOTADGL及68GANOTADGLPEGRGDYC分別在01MPBS及小牛血清中在37℃下孵育至120MIN后放化純均＞95，說(shuō)明兩種納米分子探針的體外穩(wěn)定性良好，比活度達(dá)30GBQΜMOL。5細(xì)胞攝取及洗脫實(shí)驗(yàn)。①細(xì)胞洗脫實(shí)驗(yàn)。A549及U87MG細(xì)胞能快速、高效地結(jié)合68GANOTADGL及68GANOTADGLPEGRGDYC，其對(duì)兩種細(xì)胞的結(jié)合力隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增強(qiáng)，在孵育至2H時(shí)達(dá)到高峰。②細(xì)胞洗脫實(shí)驗(yàn)。68GANOTADGL及68GANOTADGLPEGRGDYC在兩種細(xì)胞中均表現(xiàn)為隨時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢下降，且在2H末仍有顯像劑滯留。6體內(nèi)生物學(xué)分布。①正常小鼠的體內(nèi)生物學(xué)分布。68GANOTADGL及68GANOTADGLPEGRGDYC在血液中清除速度較快，放射性攝取主要分布在肝臟和脾臟，其他主要臟器放射性攝取較少。②荷瘤鼠的體內(nèi)生物學(xué)分布。分別注射68GANOTADGL及68GANOTADGLPEGRGDYC1小時(shí)后，U87MG腫瘤組織的攝取值分別為（019±002）IDG和（027±009）IDG，低于其他主要臟器組織。7荷瘤鼠的MICROPET顯像。經(jīng)尾靜脈分別注射68GANOTADGL及68GANOTADGLPEGRGDYC后，放射性攝取均主要分布在肝臟，瘤結(jié)節(jié)未見(jiàn)明顯攝取。結(jié)論通過(guò)對(duì)NOTADGL及NOTADGLPEGRGDYC的68GA標(biāo)記證明，此種標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速，且放化產(chǎn)率較高。然而68GANOTADGL及68GANOTADGLPEGRGDYC在腫瘤組織的攝取及顯像效果不理想，需要進(jìn)一步的改善和優(yōu)化。

簡(jiǎn)介：分類號(hào)墜圣2密級(jí)五單位代碼LQ三三學(xué)號(hào)Q21魚(yú)Q魚(yú)洳≥J～嗜博士學(xué)位論文中文論文題目⑧英文論文題目FUNCTIONALANALYSISOFGENESINVOLVEDININETHLONINE91ETAB0ILSMIN，／AS口丌“廳L_●●__●■L’●論文提交日期2012417AUTHOR’SSIGNATURE』INGE墜SUDERVISOR’S“2NATUREPROFZHONGHUAMASUPERVISORSIGNATURE7STHESISREVIEWER1THESISREVIEWER2THESISREVIEWER3THESISREVIEWER4●THESISREVIEWER5CHAIRDOUBLEBLINDPROFLEICAICASCOMMITTEEMAN1COMMITTEEMAN2COMMITTEEMAN3COMMITTEEMAN4COMMITTEEMAN5DATEOFORALDEFENCE2QL2531

簡(jiǎn)介：分類號(hào)單位代碼10364密級(jí)學(xué)號(hào)S10090401534安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文安徽省水稻穗腐病病原生物學(xué)特性及防治技術(shù)研究BIOLOGICALACTERIZATIONOFPATHOGENSCAUSINGRICESPIKELETROTDISEASETHETECHNOLOGYOFDISEASECONTROLINANHUIPROVINCEOFCHINA研究生費(fèi)丹指導(dǎo)教師檀根甲教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)名稱植物病理學(xué)研究方向植物病害流行與綠色防控所在學(xué)院植物保護(hù)學(xué)院答辯委員會(huì)主席二零一五年六月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名時(shí)間年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。（保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）（保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）研究生簽名時(shí)間年月日第一導(dǎo)師簽名時(shí)間年月日

簡(jiǎn)介：YL0乏1253學(xué)校編號(hào)10394圖書(shū)分類號(hào)密緩福建師范大學(xué)教育碩士學(xué)位論文案例教學(xué)在中學(xué)生物學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用嘗試APPLICATIONOFCASETEACHINGTOBIOLOGYCLASSINTHEMIDDLESCHOOL翁劍平論文評(píng)閱人論文答辯日期蘭塑曼生Q旦蘭基答辯委員會(huì)主席學(xué)位授予單位握建理墮盔堂學(xué)位授予日辯釜旦基二OO六年八ABSTRACTATPRESENT，MOSTBIOLOGYCLASSESINTHEMIDDLESCHOOLARESTILLTEACHERCENTEREDINSTCADOFSTUDENTCENTERED．STUDENTSLACKAUTONOMOUSSTUDYS．COOPERATIVELEARNINGANDPEERDISCUSSION．STUDENTS’AWARENESSOFQUESTIONS，RESEARCH，INFORMATION，ANDINNOVATIONISWEAK．CASETEACHINGISTOGUIDESTUDENTSTODISCUSSTHESPECIALBIOLOGICALCASESANDFORMTHEIROWNVIEWPOINTSANDWORKOUTSOLUTIONS．TLLISTEACHINGSTRATEGYHASBEENPROVEDTOBEEFFECTIVEANDEFFICIENTINVARIOUSTEACHINGPRACTICEATHOMEANDBROAD．ITWILLHELPACTIVATESTUDENTS’CREATIVETHINKING,RAISETHEIRINNOVATIVEIDEOLOGYANDIMPROVETHEIRPRACTICALABILITY．THISTHESISREVIEWSTHECURRENTSITUATIONOFCASETEACHINGRESEARCHATHOMEANDABROAD．INTRODUCESTHEIMPORTANCEOFCASETEACHINGRESEARCHBASEDONCONSTRUCTIVISMANDTHETHEORYOFMULTIPLEINTELLIGENCE，ANDANALYZESTHEEXITINGPROBLEMSINTHECASETEACHINGRESEARCHINTHEMIDDLESCHOOLS．THISTHESISAIMSATMAKINGANEXPERIMENTONCASETEACHINGMETHODINTHELOCALMIDDLESCHOOL，ANALYZINGTHEEXISTINGPROBLEMSINCASETEACHINGANDDRAWINGSOMEPEDAGOGICALIMPLICATIONSANDSUGGESTIONSFORCASETEACHINGSOASTOPROVETHEEFFECTIVENESSOFCASETEACHINGINBIOLOGYTEACHINGINTHEMIDDLESCH001．KEYWORDCASETEACHING，MIDDLESCHOOLBIOLOGYTEACHING，APPLICATIONⅡ

簡(jiǎn)介：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)博士學(xué)位論文人源異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶及真核起始因子2B的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究姓名張誠(chéng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)生化與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師龔為民20080501摘要化了人源EIF2BⅡ亞基并用分子置換的方法解析了其26A分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，EIF2BA的結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，根據(jù)以前生化研究的結(jié)果我們描述了EIF2BA上一個(gè)可能與EIF2或磷酸化EIF2相互作用的表面，并認(rèn)為其C端結(jié)構(gòu)域中的RDSSM猢折疊花樣可能介導(dǎo)了其與D及6亞基形成調(diào)節(jié)亞復(fù)合物，除此之外，我們還根據(jù)EIF2BA的結(jié)構(gòu)提出了其中兩個(gè)被鑒定與一類人遺傳疾病VWM相關(guān)的突變致病的可能機(jī)理。另外，我們克隆并表達(dá)純化了人源EIF2B￡亞基的C端結(jié)構(gòu)域并收集了兩套不同分辨率的晶體衍射數(shù)據(jù)，這個(gè)結(jié)構(gòu)域被證明是整個(gè)EIF2B復(fù)合物中最核心的發(fā)揮催化鳥(niǎo)苷酸交換活性的區(qū)域，其晶體結(jié)構(gòu)的解析還在進(jìn)行中，同時(shí)我們還克隆表達(dá)并純化了融合MBP的人源EIF2BP和丫亞基蛋白。所有的這些工作為以后進(jìn)一步EIF2B復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究打下了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞異戊二烯異構(gòu)酶，N端A螺旋，底物類似物，質(zhì)子供體，構(gòu)象變化，E巧2B，鳥(niǎo)苷酸交換，磷酸化EIF2，RDSSM鋤折疊，晶體結(jié)構(gòu)Ⅱ

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)TRANSWELL間接共培養(yǎng)技術(shù)研究兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位對(duì)軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響為組織工程技術(shù)修復(fù)損傷軟骨選取良好種子細(xì)胞提供依據(jù)。方法用不同消化酶將2月齡新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨分別消化成軟骨細(xì)胞和軟骨單位。按2105個(gè)細(xì)胞孔濃度接種于TRANSWELL雙層細(xì)胞培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)組軟骨單位接種于上室，軟骨細(xì)胞接種于下室；對(duì)照組下室接種軟骨細(xì)胞，上室未接種。分別在2、4、6、8天提取各組TRANSWELL下室軟骨細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。早期凋亡率檢測(cè)ANNEXINV和7AAD標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)，TUNEL染色熒光顯微鏡檢測(cè)；增殖率檢測(cè)PCNA標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)，EDU染色熒光顯微鏡檢測(cè)；相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)PCR技術(shù)檢測(cè)AGG、COLII、MMP13基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果ANNEXINV和7AAD標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)TRANSWELL下室軟骨細(xì)胞早期凋亡率發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)早期（第2、4天）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組TRANSWELL下室軟骨細(xì)胞早期凋亡率差異不明顯，差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。在實(shí)驗(yàn)第6天、第8天實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞早期凋亡率明顯低于對(duì)照組（P005）。在實(shí)驗(yàn)第6天、第8天實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組（P005）。在實(shí)驗(yàn)后期AGG、COLII基因相對(duì)表達(dá)量在第6天、第8天時(shí)實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組（P結(jié)論1軟骨單位作為關(guān)節(jié)軟骨的基本功能單位，能夠更長(zhǎng)時(shí)間有效抵抗或延緩軟骨細(xì)胞凋亡、維持軟骨細(xì)胞增殖及正向調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)相關(guān)物質(zhì)的基因表達(dá)。2軟骨單位有望在組織工程中作為種子細(xì)胞用于骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)課題為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“軟骨單位力學(xué)生物學(xué)分析及其在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中的作用（項(xiàng)目編號(hào)31271033）”的子課題。

簡(jiǎn)介：血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)的覆蓋在在全身血管內(nèi)膜上，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能除了是血液和組織的屏障，還具有其他多種功能，如降低血管通透性，調(diào)節(jié)血液與組織的物質(zhì)交換，減少無(wú)序侵入的血漿成分和血液細(xì)胞的數(shù)量；通過(guò)合成和分泌相關(guān)因子調(diào)節(jié)血管平滑肌功能；抑制白細(xì)胞的游走和侵入。鑒于這些生理功能，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是諸如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等一系列疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，研究血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制為心血管疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。本文主要探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)生變化時(shí)，存在著調(diào)控VECADHERIN，Β1整合素的糖基化“開(kāi)關(guān)”。這種作用有可能是通過(guò)GNTV催化作用進(jìn)而分配VECADHERIN，Β1整合素上NGLYCANS的豐度影響內(nèi)皮細(xì)胞功能。第一部分N乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V通過(guò)粘附分子VECADHERIN調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附本研究首先運(yùn)用THP1單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附實(shí)驗(yàn)確定IL1Β促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的最佳時(shí)間點(diǎn)和濃度點(diǎn)。其次通過(guò)WESTERNBLOT及LECTINBLOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL1Β1ΜGL1，5ΜGL1，25ΜGL1處理EAHY926細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞中GNTV蛋白及Β16GLCNAC糖支鏈的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞中總VECADHERIN蛋白水平上調(diào)。同法IL1Β5ΜGL1處理EAHY926細(xì)胞后，采用免疫共沉淀法檢測(cè)VECADHERIN上Β1，6GLCNAC糖支鏈的變化，發(fā)現(xiàn)IL1Β可使VECADHERIN上Β1，6GLCNAC糖支鏈結(jié)構(gòu)減少。另外，研究發(fā)現(xiàn)隨著IL1Β1ΜGL1，5ΜGL1，25ΜGL1濃度增加，VECADHERIN復(fù)合物中ΒCATENIN大量與其脫離。為了深入探索研究GNRV在內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)VECADHERIN復(fù)合物的影響，通過(guò)細(xì)胞中GNTV基因敲除和過(guò)表達(dá)正反兩個(gè)方面闡述GNTV作用的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明當(dāng)GNTV下調(diào)或上調(diào)，Β1，6GLCNAC糖支鏈相應(yīng)隨著變化；同時(shí)，VECADHERIN，VECADHERIN上Β1，6GLCNAC糖支鏈的變化相應(yīng)隨之減少或增加。另外，ΒCATENIN從VECADHERIN復(fù)合物上脫落的量也相應(yīng)的增加或減少，THP1單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)。為了驗(yàn)證IL1Β能夠通過(guò)影響GNTV進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，在GNTV過(guò)表達(dá)后加入IL1Β5ΜGL1處理，與GNTV過(guò)表達(dá)結(jié)果恰好相反。綜上表明GNTV可能通過(guò)改變細(xì)胞中VECADHERIN上Β1，6GLCNAC糖支鏈進(jìn)而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，炎癥因子IL1Β可能通過(guò)影響GNTV導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。第二部分IL1Β通過(guò)Β1整合素糖基化修飾誘導(dǎo)EAHY926細(xì)胞凋亡IL1Β是白細(xì)胞介素1細(xì)胞因子家族的成員之一，是最重要的炎癥細(xì)胞因子之一，它介導(dǎo)了炎癥的重要過(guò)程，已有研究顯示IL1Β可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。認(rèn)清這種細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制，將會(huì)為動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制提供較好的理論依據(jù)。為了探討IL1Β對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制，以EAHY926血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，利用不同濃度IL1Β刺激24H，采用WESTERNBLOT方法檢測(cè)IL1Β對(duì)Β1整合素，BC12，BAX，CASPASE3及N乙酞氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移VGNTV表達(dá)的影響；通過(guò)LECTINBLOT方法顯示IL1Β對(duì)GNTV所修飾的所有糖蛋白量的影響；免疫共沉淀方法檢測(cè)IL1Β對(duì)Β1整合素糖基化修飾量的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果顯示IL1Β可從蛋白翻譯水平抑制Β1整合素的表達(dá)，同時(shí)可以下調(diào)BCL2BAX的比例，上調(diào)CASPASE3的表達(dá)。初步揭示IL1Β誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)Β1整合素N連接糖基化作用來(lái)完成的。綜上所述，IL1Β可通過(guò)調(diào)控EAHY926細(xì)胞Β1整合素的糖基化修飾，增加細(xì)胞凋亡率，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。