簡介：青蒿素是目前治療瘧疾的首選藥物，但天然來源受到多種因素制約，通過基因工程方法生產(chǎn)其中間體青蒿酸、進而化學半合成青蒿素是解決資源問題的重要途徑之一。為構(gòu)建青蒿酸高產(chǎn)酵母工程株系，本論文開展了紫穗槐4，11二烯簡稱紫穗槐烯，AD的生物合成途徑工程研究并取得如下進展1ADS整合型釀酒酵母工程菌的構(gòu)建根據(jù)同源雙交換的原理，構(gòu)建可以在釀酒酵母的ΛDNA序列處進行雙交換的紫穗槐4，11二烯合酶ADS基因ADS的整合載體。ΛDNA序列在釀酒酵母基因組中大約有200個拷貝，把外源基因整合在這個位點可以大大提高外源基因在釀酒酵母中表達的拷貝數(shù)。構(gòu)建ADS整合載體首先要把釀酒酵母的強啟動子ADH和終止子連在載體上，然后把ADS基因亞克隆到強啟動子ADH和終止子之間，再連接一個營養(yǎng)缺陷型篩選標記基因URA3，還要把ΛDNA序列分成兩個交換臂連在所有待整合基因的兩端。用這個構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母，篩選出ADS整合型工程菌。得到的菌株經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后，用GCMS檢測發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)過計算，其中一株工程菌產(chǎn)紫穗槐烯的量達到1170MGL1。2ADS整合型工程菌和ADS附加體型工程菌AD產(chǎn)率比較將本論文構(gòu)建的ADS整合型工程菌和實驗室以前構(gòu)建的ADS附加體型工程菌各選3株，同時發(fā)酵培養(yǎng)，然后進行發(fā)酵液提取和GCMS檢測。結(jié)果顯示，整合型工程菌的AD產(chǎn)率明顯高于附加體型工程菌的AD產(chǎn)率P＜001。3鯊烯合酶基因SQS反義RNA表達載體的構(gòu)建設(shè)計反義RNA時，人們普遍應(yīng)用由翻譯起始位點向上下游延伸05KB30KB的片段作為重組質(zhì)粒的逆向插入序列，5’和3’非翻譯區(qū)UTR往往具有良好的效果。本研究把SOSMRNA的4個基因片段SQS15’UTR，SQS73’UTR，SQS3﹡45’UTR加5’編碼區(qū)以及SQS5﹡63’編碼區(qū)加3UTR分別反向插入到PYEDP60的GAL10CYC1半乳糖誘導型啟動子的下游，構(gòu)建成4個相應(yīng)的SOS反義RNA表達載體PYEDSQS1、PYEDSQS7、PYEDSQS3﹡4、PYEDSQS56。4SQS反義RNA表達對AD釀酒酵母工程菌生物合成的影響用上述4個SQS反義RNA表達載體分別轉(zhuǎn)化ADS整合型酵母工程菌，得到含有SQS反義RNA的ADS酵母工程菌。用GCMS檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的AD和鯊烯SQ的量，初步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入SQS反義表達載體后，鯊烯SQ和AD的產(chǎn)率比轉(zhuǎn)入前均有所下降。可能的原因是所分析的重組菌樣本量比較少，而這些重組菌中轉(zhuǎn)入的反義基因片段除了引起SQS表達下調(diào)以外，還引起ADS表達的部分抑制。本論文還開展了重組SARS未知功能小蛋白的大腸桿菌表達、純化及抗體制備研究5SARSCOV未知功能小蛋白的表達、純化、鑒定及抗體制備在大腸桿菌BL21TRXBDE3中，表達了重組SARSCOV未知功能小蛋白X4、X5和F10。對X5和F10重組蛋白進行了NI親和層析純化。F10純化時，用低濃度咪唑60MML1梯度洗脫，獲得22KD和44KD兩個蛋白條帶；在用高濃度咪唑120MML1梯度洗脫時，只有分子量大小為22KD的蛋白條帶。制備這兩種條帶并送中國科學院生物物理研究所進行LCMSMS測定，結(jié)果顯示在22KD和44KD兩種蛋白樣品中均能檢測到與F10蛋白序列100％同源的若干個片段，兩種樣品所測得的片段分別占總F10蛋白序列理論值的383％和451％，由此推測所獲得的重組蛋白就是F10蛋白，其中44KD的蛋白條帶可能是該蛋白的二聚體的形式，這也很可能是病毒進入人體后起作用的形式。在純化X5蛋白時，用和F10一樣的純化方法卻沒有得到X5蛋白，推測X5蛋白是以包涵體形式存在。用尿素變性溶解包涵體，然后所得上清用親和柱層析，TRIS緩沖液復(fù)性的辦法得到了高產(chǎn)率、高純度的蛋白。用復(fù)性后的蛋白免疫兔子得到了高效價的X5蛋白的抗血清。WESTERN免疫印跡顯示尿素變性純化再復(fù)性的X5蛋白的抗體能夠和菌體中表達的X5蛋白結(jié)合。以包涵體形式表達的X5蛋白純化后的產(chǎn)率達到933MGL1是以非包涵體形式表達的F10蛋白純化后產(chǎn)率的5倍。

簡介：點擊查看更多蠶絲蛋白-明膠復(fù)合肝組織工程材料生物相容性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的股骨頭缺血性壞死是骨科常見疾患，股骨頭壞死是由于股骨頭內(nèi)壓力增高，股骨頭骨組織不能得到營養(yǎng)血管的正常供血，使股骨頭組織中的骨細胞、骨髓、造血細胞、其他細胞發(fā)生壞死。治療股骨頭壞死是當今世界的一大難題，股骨頭壞死的主要原因是由于股骨頭的血運被破壞，從而引起了骨細胞及骨髓成分死亡及隨后的修復(fù)，繼而導致股骨頭結(jié)構(gòu)改變、股骨頭塌陷、關(guān)節(jié)功能障礙的疾病。本實驗主要是應(yīng)用組織工程技術(shù)，構(gòu)建組織工程化骨來評估體內(nèi)血管化的過程，進而為重建股骨頭的血運提供一種可行性方案。本實驗取新西蘭大白兔的骨髓間充質(zhì)干細胞，應(yīng)用富血小板血漿PRP進行體外培養(yǎng)，然后與生物相容性好的支架材料ΒTCP結(jié)合進行培養(yǎng)，由于ΒTCP三維空間具有更多的延伸方向，有助于控制干細胞生長行為，提高單位擴增速率，適于在微重力體系中模擬體內(nèi)組織細胞的生長微環(huán)境，適應(yīng)剪切力，促進骨分化。另一方面，ΒTCP本身可以作為一種很好的存貯和控釋給藥系統(tǒng)，在培養(yǎng)過程中逐步釋放骨誘導生長因子。最后將復(fù)合體放入生物反應(yīng)器中進行三維培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程化骨，將構(gòu)建的組織工程化骨植入動物體內(nèi)，3月后處死動物，取材，標本觀察，PCR及ELISA等實驗技術(shù)來觀察血管特異性標志物，從而用來評價該種構(gòu)建組織工程化骨對于血管化的影響，從而為重建股骨頭血運提供一種可行性方案。材料和方法1取23月齡的健康的新西蘭大白兔，麻醉好后放于實驗臺，備皮，固定，消毒，鋪無菌巾，在無菌條件下用穿刺針抽取雙側(cè)脛骨平臺內(nèi)下側(cè)骨髓5ML，梯度密度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法提取BMSCS，進行原代、傳代細胞培養(yǎng)。流式細胞儀鑒定。2經(jīng)兔耳緣靜脈抽取新鮮血液約10ML，在無菌條件下，迅速加入到盛有1ML5％枸櫞酸鈉的15ML離心管中，輕輕搖晃，防止凝固。3制備富血小板血漿PRP，將上述離心管中的血液放入離心機中，采用二次離心法制備富血小板血漿，第一次離心3300轉(zhuǎn)分，第二次離心3000轉(zhuǎn)分，然后得到無色透明的膠凍狀物質(zhì)即是富血小板血漿。4將制備的富血小板血漿加入到培養(yǎng)基中，3天換液一次，培養(yǎng)BMSCS。5將用富血小板血漿培養(yǎng)的BMSCS制成約1ML的細胞懸液，滴加到Β磷酸三鈣ΒTCP上，構(gòu)建細胞支架復(fù)合體，然后放入生物反應(yīng)器中用含有富血小板血漿的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周。6將在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的復(fù)合體取出，植入到新西蘭大白兔的皮下，縫合，三個月以后，取出復(fù)合體材料，然后免疫組化檢測血管標志物CD31，第Ⅷ因子關(guān)連抗原VWF的表達。結(jié)果1對于細胞形態(tài)學上的變化，可以采用倒置相差顯微鏡來觀察，13日后在顯微鏡下可以觀察到有少量的兔骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁，形狀呈不規(guī)則的短梭形。數(shù)日之后培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細胞集落群，78天后，這種細胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后，骨髓間充質(zhì)干細胞可基本鋪滿瓶底。鋪滿瓶底后，進行細胞傳代，貼壁較原代細胞快，細胞核較大，胞漿內(nèi)顆粒較原代細胞多。加入富血小板血漿PRP后，細胞的生長速度較以前明顯加快，細胞排列規(guī)整，呈明顯的漩渦狀生長。2Β磷酸三鈣ΒTCP上電鏡掃描可見有細胞粘附，細胞伸出偽足和Β磷酸三鈣ΒTCP相連接，細胞在ΒTCP多孔陶瓷支架上的黏附、伸展和增殖良好。3實驗組免疫組化結(jié)果顯示血管標志物CD31，第Ⅷ因子關(guān)連抗原VWF呈強陽性表現(xiàn)。4富血小板血漿富含多種細胞因子，可以誘導成骨或軟骨，可以促進血管化的過程。結(jié)論1原代細胞培養(yǎng)一天后，于倒置相差顯微鏡下觀察可見有細胞貼壁，呈小圓形。第二天可見有不規(guī)則性的骨髓間充質(zhì)干細胞細胞貼壁，三日后，細胞的形態(tài)發(fā)生變化，呈不規(guī)則的短梭狀（圖3）。一周后，細胞體積明顯增大，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細胞集落群，數(shù)日后，這種細胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后，骨髓間充質(zhì)干細胞可基本鋪滿瓶底，呈螺旋簇狀生長（圖4），細胞可基本長滿瓶底，生長均勻，細胞伸展充分，形態(tài)均一，并開始向多角型細胞轉(zhuǎn)化，呈明顯的旋渦狀生長。2骨髓間充質(zhì)干細胞是組織工程中較理想的種子細胞。因為骨髓間充質(zhì)干細胞來源比較豐富，取材也方便，同時分離方法也較簡單，采用淋巴細胞分離液可以分離大量的骨髓間充質(zhì)干細胞，具有穩(wěn)定的體外培養(yǎng)性能，并且易于傳代。3富血小板血漿富含多種細胞因子，可以誘導成骨或軟骨，可以促進血管化的過程。4Β磷酸三鈣ΒTCP在組織工程支架材料的選擇方面具有較多的優(yōu)勢，由于其較好的組織相容性和三維立體結(jié)構(gòu)，所以，骨髓間充質(zhì)干細胞適合于在Β磷酸三鈣ΒTCP支架材料上黏附和增殖。5灌注型生物反應(yīng)器對骨髓間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生力學刺激，可以使細胞在三維支架材料上更好的黏附和增殖。

簡介：松果菊苷既是一種咖啡酸類衍生物，也是一種苯乙醇苷類化合物，具有多種藥理學活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護作用、保肝作用以及對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用。松果菊苷最早發(fā)現(xiàn)于狹葉松果菊，其含量約為02％，后亦在克氏釣鐘柳中發(fā)現(xiàn)，含量約為009％。目前，松果菊苷主要從一種寄生于梭梭的管花肉蓯蓉中提取。在2005版中華人民共和國藥典中，管花肉蓯蓉的唯一質(zhì)量控制標準是，松果菊苷的含量不低于1O％。管花肉蓯蓉只分布于沙漠和戈壁一帶，生長緩慢，且難于栽種。然而，近年來隨著松果菊苷商業(yè)價值的不斷提高，管花肉蓯蓉的市場需求也在不斷增長，管花肉蓯蓉被過度開發(fā)，已經(jīng)成為瀕危植物。因此，尋找管花肉蓯蓉的替代資源顯得尤為緊迫。本研究通過高效液相色譜篩選到富含松果菊苷的藥源植物紅花釣鐘柳PENSTEMONBARBATUSCANROTH，利用高速逆流色譜快速分離制備松果菊苷純品用于波譜學鑒定。為了提高次生代謝產(chǎn)物松果菊苷的含量，利用分子生物學方法，在其生物合成的基因工程領(lǐng)域開展了探索性研究。獲得的主要結(jié)果如下1首次發(fā)現(xiàn)紅花釣鐘柳中含有松果菊苷，并測定了根和葉中含量的年變化。通過篩選首次發(fā)現(xiàn)紅花釣鐘柳含有松果菊苷，其根和葉中松果菊苷的含量隨季節(jié)變化，在一年中，最高含量分別在十一月和五月達到725±036MGG和909±032MGG。結(jié)果表明，紅花釣鐘柳中松果菊苷的含量十分接近管花肉蓯蓉中松果菊苷的含量水平，其有可能替代管花肉蓯蓉，而用于規(guī)?；a(chǎn)松果菊苷。2利用循環(huán)高速逆流色譜等技術(shù)從紅花釣鐘柳根中得到含量為963％的松果菊苷純品420MG，并確定其結(jié)構(gòu)。從紅花釣鐘柳中分離得到松果菊苷純品。利用50％甲醇超聲提取20G紅花釣鐘柳根的粉末，所得到的甲醇提取物經(jīng)AB8樹脂預(yù)純化后，以正丁醇甲醇11，VV為溶劑系統(tǒng)，通過經(jīng)典高速逆流色譜和循環(huán)高速逆流色譜純化。最終獲得了純度為963％的松果菊苷420MG。循環(huán)HSCCC的回收率為910％。獲得的松果菊苷純品由IR1HNMR13CNMR進行了結(jié)構(gòu)確認。3完成了狹葉松果菊中3脫氫奎尼酸合成酶基因AROB的克隆及其組織表達特征研究。以狹葉松果菊ECHINACEAANGUSTIFOLIADC組培苗為材料，用TRIZOL法提取總RNA，根據(jù)已有的3脫氫奎尼酸合成酶基因AROB保守氨基酸序列設(shè)計簡并引物，通過RTPCR擴增得到1條289BP的AROB基因同源片段。利用該已知中間序列，通過快速擴增CDNA末端技術(shù)RACE及序列拼接最終得到該基因CDNA序列，命名為EANAROB，GENBANK登錄號為EU293857。分析結(jié)果表明，EANAROBCDNA長1424BP，包含一個1326BP的開放讀碼框，氨基酸序列同源分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EANAROB編碼的氨基酸序列與番茄、葡萄、擬南芥、山毛櫸的AROB同源性都在80％左右，表明AROB氨基酸序列具有較強的保守性。半定量RTPCR結(jié)果表明，狹葉松果菊EANAROB基因在狹葉松果菊的根、莖、葉、花中均有表達，但花和葉中的表達量較高，在根和莖中較少。4構(gòu)建了PCAMBIA2301GEAC4H1高效植物表達載體并獲得基因工程農(nóng)桿菌對含有源于狹葉松果菊的EAC4H1GENBANK登錄號為EU676019的PMD18T和中間表達載體PCAMBIA2301G分別進行SACⅠ和XBAⅠ雙酶切。由于EAC4H1基因內(nèi)含有SACⅠ酶切位點，經(jīng)不完全酶切產(chǎn)生4條電泳條帶，回收1602BP的目的基因條帶和約12KB的PCAMBIA2301G載體骨架條帶。將回收的PCAMBIA2301G載體骨架與酶切后產(chǎn)生的EAC4H1目的基因片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Α。抽提質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。經(jīng)PCR驗證，獲得與目的基因大小一致的條帶。結(jié)果表明工程農(nóng)桿菌LBA4404PCAMBIA2301GEAC4H1已構(gòu)建成功。上述工程菌可用于遺傳轉(zhuǎn)化狹葉松果菊或紅花釣鐘柳，對在分子遺傳學水平上探討CAH在咖啡酸衍生物生物合成中的作用機理，并為進一步獲得富含松果菊苷的轉(zhuǎn)基因狹葉松果菊和紅花釣鐘柳奠定了基礎(chǔ)。

簡介：20世紀初生物學領(lǐng)域機體論與還原論之爭，促成了一般系統(tǒng)論的誕生。盡管會遇到各種困難，但這的確是促進科學統(tǒng)一的一次科學革命?？茖W發(fā)展過程中，在承認機械還原論優(yōu)點的同時，更需要一個比之更完善的方法論指導。系統(tǒng)論思想強調(diào)低層次的事物和高層次的事物都需要關(guān)注，系統(tǒng)局部的變化會引起其它局部和整體的反應(yīng)，具體到生命系統(tǒng)而言，就是要既關(guān)心化學層次或分子層次上的事物，又關(guān)心較高的生命組織層次上的事物。生物醫(yī)學工程學是促進生命健康的工程學科，無論是學科基礎(chǔ)理論的發(fā)展，還是工程技術(shù)的研發(fā)，都需要從整體的角度和動態(tài)的角度研究人體系統(tǒng)的變化規(guī)律，尤其是針對局部問題的解決方案，需要綜合考慮與生命系統(tǒng)整體的切合性。本文根據(jù)系統(tǒng)哲學原理對生物醫(yī)學工程發(fā)展史與方法論進行了探討。主要包括以下四部分內(nèi)容一、生物醫(yī)學工程發(fā)展史概述。生物醫(yī)學工程學的快速發(fā)展始于20世紀50年代，“生命”和“工程”是生物醫(yī)學工程的兩個核心要素。這里的生命，包括生命個體的健康和生命群體的延續(xù)，而這也一直是其使命之源。工程則包括個體生命的健康問題工程和群體生命的公平公正工程。相伴醫(yī)學的發(fā)展，通過解決生命系統(tǒng)健康問題成就健康的個體生命通過促進診斷治療的簡便化和低成本化，成就健康的群體生命。本文根據(jù)系統(tǒng)哲學的事物發(fā)展演化的基本規(guī)律重新審視生物醫(yī)學工程學的概念和特點，并在分析生物醫(yī)學工程學發(fā)展概況的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了解決特殊問題和局部問題時遇到的困境，而這些很多已被證實是由于對系統(tǒng)整體涌現(xiàn)產(chǎn)生的新特性和功能認識的缺失所致。二、科學技術(shù)發(fā)展演化的系統(tǒng)哲學方法論探討。基于多種視角，人類在審視自己的同時，不斷嘗試著解讀大自然。人們不斷發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)造事物之間的多種聯(lián)系方式，試圖追問自然。而我們在掃描這些解讀自然和追問自然的過程、方式、內(nèi)容和結(jié)果時，亦在試著描述系統(tǒng)的物質(zhì)、能量和信息的交換及其方式，并極力探索其要素、結(jié)構(gòu)和功能的變化。本文試圖從事物發(fā)展所遵循的系統(tǒng)哲學的差異協(xié)同律、層次轉(zhuǎn)化律和整體優(yōu)化律角度，對科學技術(shù)這一復(fù)雜系統(tǒng)演化的實質(zhì)、動力、形式、過程進行探討。多元性、差異性、相關(guān)性、整體性是這個復(fù)雜系統(tǒng)的特點，差異是促成這個系統(tǒng)的發(fā)展動力，協(xié)同則在差異基礎(chǔ)上成就了系統(tǒng)的整個發(fā)展歷程，自組織涌現(xiàn)表達了系統(tǒng)發(fā)展演化的形式，層級轉(zhuǎn)化和整體優(yōu)化則表達了科學技術(shù)系統(tǒng)的發(fā)展過程。三、人體組織器官的協(xié)同優(yōu)化及自組織行為分析。開放性、多元性、層次性、相關(guān)性、動態(tài)性、整體性充分表達了人體系統(tǒng)的特點，協(xié)同優(yōu)化和自組織行為是其典型的系統(tǒng)行為。本文對骨骼結(jié)構(gòu)和功能的認識歷程進行了簡單梳理，并進行了骨的協(xié)同優(yōu)化及其自組織行為分析，提出開放與非平衡是骨力學自組織行為的前提條件，差異信息是骨力學自組織行為的源動力。骨的功能適應(yīng)性原理充分證實了骨的協(xié)同優(yōu)化及自組織行為。四、生物醫(yī)學工程發(fā)展史研究的方法論探討。生物醫(yī)學問題訴求，研究過程的實踐介入，研究方法的實證性表達了生物醫(yī)學工程發(fā)展史研究的實證性原則問題生成的生態(tài)環(huán)境，交叉學科的整體關(guān)照，影響因子的綜合考量表達了生物醫(yī)學工程發(fā)展史研究的整體性原則研究基礎(chǔ)的歷史性積淀，研究過程的歷史性考察，研究體系的歷史性結(jié)合表達了生物醫(yī)學工程發(fā)展史研究的歷史性原則尊重生命的歷史軌跡，聚焦人體系統(tǒng)的歷史軌跡，人與外界的作用軌跡表達了生物醫(yī)學工程發(fā)展史研究的生命適切性原則傳統(tǒng)分析方法的不足使其隱匿，系統(tǒng)分析方法以全新的活力面對生命系統(tǒng)，系統(tǒng)分析方法本就是表達系統(tǒng)自組織演化方式的一種方法。本文把人體視為一個復(fù)雜的巨系統(tǒng)，研究其運行中會產(chǎn)生諸多只因系統(tǒng)整體的存在而涌現(xiàn)出的新的特性、結(jié)構(gòu)和功能，這些新生事物是系統(tǒng)各部分不能產(chǎn)生的，也是系統(tǒng)各部分簡單疊加后不能產(chǎn)生的，只有在各部分因某種需要和某些聯(lián)系形成“牽一發(fā)而動全身”的有機整體方可產(chǎn)生。必須在系統(tǒng)論指導下審視人體生命系統(tǒng)的特性、結(jié)構(gòu)和功能，并運用強調(diào)整體和動態(tài)的系統(tǒng)方法論，指導生物醫(yī)學工程研究（這也是生物醫(yī)學工程學學科本身性質(zhì)使然），進而回答生命個體或群體的健康問題。

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簡介：分類號UDC密級學位論文基于逆向工程的牙種植體連接系統(tǒng)生物力學分析及動物實驗研究作者姓名指導教師申請學位級別學科專業(yè)名稱論文提交日期學位授予日期評閱人張浩良藺增副教授東北大學機械工程與自動化學院碩士學科類別專業(yè)學位機械工程2014年6月趣寥億論文答辯日期2014年6月答辯委員會主席京鋒J勾J東北大學獨創(chuàng)II’生聲明本人聲明，所呈交的學位論文是在導師的指導下由本人獨立完成的。論文中取得的研究成果除加以標注和致謝的地方外，不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包括本人為獲得其他學位而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均己在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名日期學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者和指導教師完全了解東北大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定即學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人同意東北大學可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索、交流。作者和導師同意網(wǎng)上交流的時間為作者獲得學位后半年口學位論文作者簽字日期礪知商兩象吼兩名期簽日幣IYT一導整

簡介：研究背景及目的輸尿管損傷后常常導致輸尿管缺損或狹窄，繼發(fā)患側(cè)尿路梗阻、感染、尿外滲、尿性囊腫等并發(fā)癥，嚴重威脅患者的健康及生活質(zhì)量。對于損傷程度較重、缺損段較長的損傷，臨床上常以胃腸道替代輸尿管的方法處理。然而，腸代輸尿管后常伴隨各種并發(fā)癥的發(fā)生，如尿路結(jié)石，慢性感染，腸粘連等。有研究者嘗試使用人工合成材料或者異體移植的方法進行處理，但是治療效果均不滿意。因此，輸尿管損傷后缺損的治療已經(jīng)成為泌尿外科的亟待解決的問題之一。組織工程科學的發(fā)展為輸尿管損傷及缺損的修復(fù)重建提供了新的途徑。組織工程的方法進行輸尿管重建必須解決兩個關(guān)鍵問題支架材料及種子細胞。本研究以人脂肪干細胞為種子細胞，以聚乳酸／膠原為基本材料制作一種新型輸尿管支架材料，擬為輸尿管組織工程重建提供一種新的可行的治療方法。研究的主要目的為L、探索人脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法，為以脂肪干細胞為種子細胞的研究提供實踐基礎(chǔ)2、探索人脂肪干細胞誘導分化為尿路上皮的可行性；為輸尿管組織工程研究提供新的種子細胞來源3、制作一種新型組織工程輸尿管支架，并評估這種新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細胞的生長、增殖4、將攜帶細胞的新型輸尿管支架置入裸鼠體內(nèi)，評價材料的生物相容性，觀察支架材料內(nèi)細胞存活狀態(tài)、誘導分化后的細胞表型能否保持，以初步評估利用這種新型輸尿管支架材料進行組織工程輸尿管的可行性。方法1取吸脂術(shù)患者皮下脂肪組織，采用酶消化法分離人脂肪干細胞，通過流式細胞學的方法鑒定其表型特征，通過成脂、成骨誘導初步鑒定其分化潛能。2通過TRANSWELL間接共培養(yǎng)法進行脂肪干細胞向尿路上皮細胞的誘導分化，采用RTPCR、WESTERNBLOT、免疫熒光的方法對誘導后的細胞進行尿路上皮標志物的CK18，UP2表達鑒定。3以聚乳酸及I型膠原作為基本原料，采用溶劑揮發(fā)法及電紡絲方法制作一種新型生物可降解輸尿管支架材料，將脂肪干細胞與支架材料進行體外復(fù)合培養(yǎng)，通過電鏡、LIVEDEAD、HE染色、MTT等方法評估新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細胞的生長、增殖。4將攜帶人脂肪干細胞的新型輸尿管支架材料植入裸小鼠（4周齡雌性）背部皮下，生長14天后取材，進行細胞徑際分析、HE染色、尿路上皮標志物的免疫熒光鑒定。結(jié)果1采用酶消化法分離的脂肪干細胞在細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)呈貼壁生長，倒置光學顯微鏡下觀察呈長梭形，流式細胞學檢測表明，細胞表達間充質(zhì)干細胞的標志物（CD29，CD44，CD90以及CD105），不表達造血干細胞標志物CD31及組織相容性抗原標志HLADR。成脂誘導14天后細胞內(nèi)可見大量脂滴，并且油紅O染色呈陽性；成骨誘導21天后，茜素紅染色后觀察可見鈣結(jié)節(jié)形成。2通過與尿路上皮的間接共培養(yǎng)7天后，誘導后的細胞形態(tài)呈現(xiàn)尿路上皮細胞樣，培養(yǎng)14天后，RTPCR及WESTERNBLOT可檢測到尿路上皮標志物CK18、UP2在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平上調(diào)。免疫熒光檢測表明，40％50的誘導后的干細胞表達尿路上皮標志物（CK18及UP2）。3電鏡觀察聚乳酸／I型膠原輸尿管支架材料的表面具有三維空間結(jié)構(gòu)，材料由直徑約3微米344±094ΜM的纖維構(gòu)成，纖維間形成孔徑約10微米1054±318ΜM的孔隙。細胞支架體外孵育培養(yǎng)后3天，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)支架材料表面細胞呈鋪展狀態(tài)，均勻分布于支架表面；MTT實驗對細胞種植在支架后第L，3，5，7天進行連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)攜帶膠原的支架材料細胞呈現(xiàn)持續(xù)增殖的趨勢；細胞種植7天后HE染色發(fā)現(xiàn)細胞均勻分布于支架材料表面，部分細胞浸潤生長進入材料的內(nèi)部；LIVEDEAD檢測發(fā)現(xiàn)材料上生長的細胞90以上為活細胞。4所有16只動物在攜帶細胞的新型輸尿管支架材料植入體內(nèi)14天的實驗期間均安全存活，傷口愈合良好，無感染、炎癥反應(yīng)發(fā)生，誘導后的人脂肪干細胞能夠在裸鼠體內(nèi)存活達14天，浸潤入支架材料的內(nèi)部，并能夠表達尿路上皮的標志物。結(jié)論1、采用酶消化法提取人脂肪干細胞是可行的，提取的細胞能夠表達間充質(zhì)細胞的標志物，具有良好的增殖及分化潛能。2、采用間接共培養(yǎng)法能夠誘導人脂肪干細胞向尿路上皮細胞分化，誘導分化后的細胞形態(tài)發(fā)生改變，并且可表達尿路上皮的標志物。3、采用聚乳酸／I型膠原材料制作的新型輸尿管支架材料，能夠適合人脂肪干細胞的生長增殖。4、體內(nèi)植入實驗證實攜帶細胞的新型輸尿管支架材料具有良好的生物學性能，誘導分化后的人脂肪干細胞在隨支架植入體內(nèi)后能夠存活、生長并保持其分化特征。本研究為輸尿管組織工程重建提供了新的有希望的治療方案。

簡介：本文采用酶消化法獲取的豬頸總動脈脫細胞基質(zhì)作為組織工程血管支架，采用組織貼塊法培養(yǎng)幼年家犬胸主動脈VSMC，膠原酶消化法培養(yǎng)EC，傳代純化，獲得了足夠數(shù)量、高純度的家犬VSMC和EC種子細胞，將VSMC種植在制備好的脫細胞支架上進行培養(yǎng)，對其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物力學特性和血管壁細胞的功能進行研究，以獲得能應(yīng)用于臨床的理想的血管替代物、為血管組織工程的的發(fā)展提供有意義的資料。研究結(jié)果表明，本文研制的血管自動旋轉(zhuǎn)種植培養(yǎng)系統(tǒng)有利于種子細胞在支架腔面及管壁內(nèi)均勻生長；本文構(gòu)建的組織工程血管其最大斷裂強度、粘彈性等生物力學特性指標，都接近生理血管，提示具有較理想的生物力學特性；VSMC與EC在脫細胞支架上生長良好，具有一定的生理功能，兩者相互影響，并參與了血管重建。

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簡介：組織工程學是一門跨學科的新領(lǐng)域，旨在應(yīng)用工程學和生命科學的原理建造能夠用于重建、維持或提高缺損組織功能的生物性人體組織。近年來，隨著細胞支架材料的不斷發(fā)展和組織構(gòu)建技術(shù)的日趨成熟，國內(nèi)、外的科研人員已經(jīng)成功地在動物體內(nèi)培育出組織工程化人工軟骨。在美國，一種組織工程化人工軟骨產(chǎn)品已經(jīng)通過FDA批準進入臨床。國內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究近年來也已經(jīng)取得突破性進展，有望近年內(nèi)開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的組織工程化人工軟骨產(chǎn)品。關(guān)節(jié)軟骨具有重要的生理功能，但損傷后自身修復(fù)能力有限。幾十年來，科學家和外科醫(yī)生們一直致力于軟骨缺損的修復(fù)研究，但進展緩慢。由于軟骨組織具有能夠保持移植活力、吸收少等優(yōu)點，在臨床上獲得廣泛應(yīng)用，但在應(yīng)用過程中供體材料來源有限，需二次手術(shù)，而且自體肋軟骨移植還有遠期鈣化傾向；同種異體及異種軟骨移植物都不同程度地存在自溶現(xiàn)象，還會引起免疫排斥反應(yīng)甚至傳播病原。基于以上這種現(xiàn)實情況，嘗試新的技術(shù)和手段進行軟骨缺損治療迫在眉睫。組織工程研究為修復(fù)因各種原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨缺損帶來了希望。近年來軟骨組織工程的進展并不順利，主要是因為缺乏理想的種子細胞和適宜的支架材料。在種子細胞方面，自體軟骨細胞來源有限，異體或異種軟骨細胞又往往會出現(xiàn)自溶和免疫排斥。骨髓間充質(zhì)干細胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS是一類具有多向分化潛能的組織干細胞，在體外特定的誘導條件下可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)、肌腱、韌帶等多種組織。該細胞群來源易得，取材方便，增殖能力強，可在體外大規(guī)模擴增而不丟失多分化潛能，并且異體移植時排斥反應(yīng)小，因此是軟骨組織工程種子細胞的潛在來源。在支架材料方面，以往研究中多采用聚合物、膠原等材料，而這些材料均不同程度地存在生物相容性差、機械強度不足等問題。近年來法國地中海大學成功地研制了微孔結(jié)構(gòu)可控的ΒTCP多孔陶瓷材料，該材料不僅具有良好的生物相容性和較高的機械強度，而且能夠根據(jù)需要調(diào)節(jié)材料在體內(nèi)的降解時間。這些特性表明，該材料是非常有潛力的一類組織工程細胞支架材料。目前國內(nèi)外以ΒTCP陶瓷作為植骨材料的研究報道較多，但尚未見將其作為細胞支架材料的研究報道。本研究探討了以ΒTCP為支架材料，以MSC為種子細胞構(gòu)建組織工程化生物型人工軟骨，修復(fù)大動物關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性，從而為關(guān)節(jié)軟骨組織工程的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展開辟道路。本研究共分兩部分。第一部分進行了軟骨組織工程種子細胞的研究。采用密度梯度離心法分離純化了人骨髓間充質(zhì)干細胞，并對細胞進行了表型鑒定和生物學活性分析，在此基礎(chǔ)上進行了向軟骨細胞的誘導分化。結(jié)果表明，采用密度為1073GML的PERCOL密度梯度離心法可以有效分離MSC，細胞具有未分化細胞的表型，純度大于97％。組織化學染色和細胞生長曲線測定顯示，獲得的細胞具有MSC的生物學特征。體外誘導分化表明該細胞可向軟骨細胞分化。第二部分進行了組織工程化軟骨的體外構(gòu)建和體內(nèi)應(yīng)用研究。將軟骨細胞接種到支架材料上，進行體外培育，發(fā)現(xiàn)細胞可以順利爬入材料的孔洞內(nèi)和孔洞間，貼附增殖并分泌細胞外基質(zhì)，顯示材料良好的生物相容性。將構(gòu)建的MSCΒTCP復(fù)合體植入體內(nèi)修復(fù)羊關(guān)節(jié)軟骨缺損，顯示3個月時關(guān)節(jié)軟骨得到明顯修復(fù)，6個月時缺損區(qū)基本被新生軟骨組織所替代。綜合以上結(jié)果，本研究表明，MSC可以作為軟骨組織工程的種子細胞，其在體內(nèi)環(huán)境的誘導下可以形成軟骨組織；ΒTCP是軟骨組織工程一種較為理想的支架材料，以其為支架，以MSC為種子細胞構(gòu)建組織工程化生物性人工軟骨具有臨床應(yīng)用潛力和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)前景。

簡介：人工瓣膜置換術(shù)是目前世界上治療心臟瓣膜疾病的主要常規(guī)方法，人工瓣膜包括機械瓣和生物瓣兩大類。它的發(fā)明挽救了大部分瓣膜病患者生命，并提高了其生存質(zhì)量。但是都未達到理想程度，比如機械瓣需要終生抗凝，并且存在潛在性的出血、血栓形成和瓣體脫落引起栓塞的危險；生物瓣耐久性不足，易鈣化、變性、衰敗、穿孔而失去功能。最重要的是人工瓣膜不具有再生長的性能，特別是主要應(yīng)用于兒童的同種管道等等，因而在兒童病人的應(yīng)用中受到極大的限制12目前只有自體管道如ROSS手術(shù)中將自體肺動脈移植到主動脈位置，才能保持瓣膜和管道的繼續(xù)生長3但是ROSS手術(shù)要求技術(shù)難度高，風險大并且也只能適用于很少的一部分兒童病人，而且尚存在一些不確定因素例如管道是否確切地能擔負起同步生長而完全適應(yīng)其未來的生理需要呢4所以尋找一種更加完善的瓣膜替代物，研發(fā)組織工程心臟瓣膜是其中一項具有廣闊前景的方法并且已經(jīng)取得了可喜進展。組織工程學就是應(yīng)用生物學和工程學的原理來發(fā)展一種可替代的組織，代表了一種新興的科學概念，在體外制造出有活性細胞的間質(zhì)組織并具有抗血栓的表面，從而擁有自我修復(fù)和再塑形的能力，從而克服上述缺陷。截止目前，世界上已經(jīng)有組織工程皮膚和組織工程膀胱研制成功的報道?，F(xiàn)行組織工程的研究內(nèi)容有三個關(guān)鍵部分，種子細胞選擇、支架材料選取和復(fù)合技術(shù)的改進。早期，大多數(shù)組織工程瓣膜實驗研究中多采用血管來源細胞，從而不可避免地具有一定缺陷，如細胞的收集必須要犧牲供體完整的血管結(jié)構(gòu)，并且因其細胞特性不同于瓣膜間質(zhì)細胞，可能影響組織工程瓣膜的功能。骨髓間充質(zhì)干細胞（BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSBMSCS）可由受體骨髓采集，在體外分離和擴增而獲得，并且可定向分化成各種細胞，包括骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞等等，亦有報道稱有向內(nèi)皮細胞方向分化者。本課題選擇羊BMSCS作為種子細胞，因為其易于通過簡單的骨髓穿刺而獲取，可以避免增加副損傷；BMSCS具有多向分化潛能、且能貼附在異體支架材料上生長擴增，在一定的微環(huán)境下有向瓣膜間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞分化的可能性。支架材料仍采用本中心研究的去細胞豬主動脈瓣膜支架作為組織工程心臟瓣膜支架、并著重引進PEG水凝膠技術(shù)，改進細胞與材料支架的復(fù)合方法，進行體外構(gòu)建組織工程心臟瓣膜；然后植入細胞供體羊的腹主動脈內(nèi)進行觀察，避免免疫排斥反應(yīng)的干擾，觀察體內(nèi)微環(huán)境對組織形成和細胞分化的影響。對組織工程心臟瓣膜的構(gòu)建進行進一步的研究與探索。第一部分分離、純化、擴增并鑒定羊BMSCS細胞經(jīng)PERCOLL密度梯度離心和貼壁生長的方法從采集的羊骨髓液中提取，通過倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，通過免疫組化及定向分化來進行鑒定。結(jié)果羊BMSCS免疫組化染色顯示SH2VIMENTIN均呈陽性表達。CD34和VIII因子相關(guān)抗原的表達均為陰性。經(jīng)向脂肪細胞定向誘導分化后，油紅O染色顯現(xiàn)明顯的胞內(nèi)脂滴。結(jié)果表明經(jīng)此種方法分離純化而來的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，具有多向分化潛能，而且細胞數(shù)量和活性滿意10～15ML羊的骨髓在20D左右經(jīng)4～6代培養(yǎng)后即可達到652±024107細胞數(shù)量級，能滿足組織工程種子細胞的需求。；第二部分去細胞豬主動脈瓣和改性PEG水凝膠的制備采用滲透壓和TRITONX100結(jié)合的辦法制備去細胞豬主動脈瓣膜支架，并且進行PEG水凝膠的改性，結(jié)合RGD、TGFΒ1和VEGF，將BMSCS靜態(tài)種植于其上進行培養(yǎng)，并對種植細胞的效果進行初步評價。結(jié)果應(yīng)用組織切片HE染色和掃描電鏡的方法證實BMSCS細胞的生物相容性較好，PEG水凝膠可以混勻細胞，并將細胞緊密結(jié)合到去細胞生物支架上PEGTEHV組的細胞貼附率明顯高于NONPEG組2592±0005VS1885±0004；摸索出有效貼附到瓣膜上的細胞接種方法，可提高種子細胞的貼壁率和有效分布，為下一步體內(nèi)實驗打下基礎(chǔ)；第三部分體內(nèi)腹主動脈移植實驗以去細胞豬主動脈單瓣為支架、自體BMSCS為種子細胞包裹于改性PEG水凝膠完成細胞與支架的復(fù)合過程，當單葉的組織工程瓣膜種植進細胞供體羊的腹主動脈內(nèi)，我們進行BMSCS種子細胞的體內(nèi)分化趨勢的觀察。組織工程心臟瓣膜PEGTEHV作為A組；種植BMSCS細胞但無PEG包被處理作為B組；山羊自身主動脈瓣膜設(shè)為C組為對照。分別于術(shù)后第16周后取材進行形態(tài)、組織學、掃描和透射電鏡觀察以及生物力學檢測。分析BMSCS細胞在體內(nèi)的分化方向及比較三組之間的異同。結(jié)果A組張力強度、內(nèi)皮細胞覆蓋率明顯優(yōu)于B組085±002014±001；其中A組B組附壁血栓形成率為0100％；A組生物力學強度接近羊自身主動脈瓣膜；并且骨髓間充質(zhì)干細胞于體內(nèi)微環(huán)境下向內(nèi)皮細胞和肌成纖維細胞等細胞分化。利用改性聚乙二醇（PEG）水凝膠復(fù)合去細胞生物支架材料以及自體骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程瓣膜具有可行性。

簡介：背景游離脂肪組織移植是臨床上具有廣泛用途的一種方法，但因移植后的脂肪組織吸收率高、造成供區(qū)繼發(fā)畸形等缺點而受到限制。組織工程技術(shù)的發(fā)展為脂肪組織移植指明了前景。目前已證實脂肪組織來源的干細胞（S）具有體內(nèi)外多向分化潛能，但目前所能獲得的S是位于人脂肪組織內(nèi)的一個混雜細胞群體，只有大約40的細胞能向脂肪細胞分化。因此，S并不能完全滿足脂肪組織工程的發(fā)展需要，尋找一種增殖能力強、成脂分化率高、易于分離的更理想的種子細胞仍然是研究熱點。脂肪組織內(nèi)除了含有上述的干細胞外，其主要成分是成熟脂肪細胞，脂肪細胞因大量的脂質(zhì)聚集而具有漂浮性，難以體外培養(yǎng)。傳統(tǒng)觀念認為脂肪細胞是處于分化終末階段，缺乏增殖能力的一種細胞。然而，國外有研究表明，成熟脂肪細胞在體外培養(yǎng)的過程中，能發(fā)生脂質(zhì)分解變化，重新啟動增殖機制并分裂增殖。這種生理轉(zhuǎn)變被稱為脂肪細胞去分化，由去分化得到的細胞被稱為去分化脂肪細胞（DA）。廖云君等的研究證實DA在體外定向誘導培養(yǎng)下具有向成脂、成骨、成軟骨分化等多向分化能力，且較之S有更高的成脂能力。因此，DA有可能成為脂肪組織工程更具前景的種子細胞來源。然而，目前國內(nèi)外對如何高效提純成熟脂肪細胞并獲取DA、DA的多向分化潛能的研究還很少，尚未見應(yīng)用DA作為種子細胞在體內(nèi)進行組織工程化脂肪組織的構(gòu)建。本研究將針對上述問題進行探討。目的1通過從人脂肪抽吸物的脂質(zhì)部分分離、提純成熟脂肪細胞，并進行體外培養(yǎng)，研究脂肪細胞去分化現(xiàn)象，探討脂肪細胞去分化的原理和方法。2通過對DA的形態(tài)觀察和定向誘導，探討DA的形態(tài)學特點和多向分化潛能。3通過動物實驗，將DA與FG可注射性支架混合后注射于裸鼠皮下試構(gòu)建組織工程化脂肪，探討DA作為脂肪組織工程種子細胞的可行性和潛力。方法從成人吸脂術(shù)后的抽吸物提取成熟脂肪細胞及S，天花板貼壁培養(yǎng)法使成熟脂肪細胞去分化，觀察細胞形態(tài)變化，并獲得DA。油紅“O”染色、阿爾辛藍染色、茜素紅染色分別鑒定DA成脂分化、成軟骨、成骨分化分化結(jié)果；光鏡及掃描電鏡檢測DA及S與FG支架的相容性；將DIⅠ熒光染料標記過的DAFG混合物（A組，N8，細胞量410S）和SFG混合物（B組，N8，細胞量4106）以及空白FG支架（C組，N8）注射于裸鼠皮下。8周后將新生組織取出，給予大體觀察和濕重測定，HE染色、H染色和油紅“O”染色后進行組織學觀察、纖維化比率定量測定和熒光顯微鏡觀察以鑒定新生物的性質(zhì)、來源。結(jié)果人成熟脂肪細胞在天花板貼壁法培養(yǎng)下能去分化為成纖維細胞狀細胞，經(jīng)過多向分化誘導檢測證實該細胞為DA。成脂分化兩周，油紅“O”染色可見DA內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴；成軟骨分化兩周，阿爾辛藍染色可見DA內(nèi)軟骨基質(zhì)沉積成骨分化三周，茜素紅染色可見DA內(nèi)出現(xiàn)紅色鈣鹽沉積。體內(nèi)實驗中A組和B組8周后在裸鼠背部皮下均有新生組織塊形成，濕重的X±S分別為01249±00190（G）和00971±00166（G）（F12350，P001）。纖維化比率的X±S分別為1420±2625和2589±5314（F34678，P0001）。C組未見新生組織形成，支架被完全吸收。新生組織經(jīng)檢測后證實其為成熟脂肪塊并來源于植入的種子細胞。結(jié)論1從成人脂肪抽吸物脂質(zhì)部分中可以分離、提純得到大量的成熟脂肪細胞。2成熟的脂肪細胞在體外培養(yǎng)條件下可去分化為DA，DA呈成纖維細胞狀，增殖活性強，并具有多向分化能力。3DA與FG支架混合后注射于裸鼠皮下能初步形成組織工程化脂肪；較之S，DA構(gòu)建出的脂肪塊具有濕重大，纖維化比率低等優(yōu)點。DA是脂肪組織工程理想的種子細胞。

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