簡介：背景1、制造小口徑組織工程血管是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)仿生應(yīng)力對小口徑組織工程血管的生長和成熟非常重要但目前的很多灌注培養(yǎng)式生物反應(yīng)器尚不能提供模擬生理血流的動力學(xué)環(huán)境而且未提供足夠的生物學(xué)數(shù)據(jù)來證明其優(yōu)越性2、小口徑組織工程血管的功能和生物力學(xué)特性都離不開平滑肌細(xì)胞的良好增殖但平滑肌細(xì)胞在接種到支架材料后的增殖情況并不令人滿意從而影響小口徑組織工程血管的功能和生物力學(xué)強(qiáng)度。目的1、構(gòu)建小口徑組織工程血管體外仿生搏動流體應(yīng)力條件下進(jìn)行培養(yǎng)觀察對小口徑組織工程血管的生物學(xué)作用2、構(gòu)建平滑肌細(xì)胞受仿生搏動應(yīng)力模型探討仿生搏動應(yīng)力促平滑肌細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。方法1、1酶消化法分離獲得內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)VIII因子相關(guān)抗原免疫組化染色和Α肌動蛋白免疫熒光染色分別鑒定內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的表型2用不使用胰酶的化學(xué)方法制備脫細(xì)胞兔主動脈支架材料觀察大體形態(tài)行組織學(xué)觀察、掃描電鏡和透射電鏡觀察CCK8法評價(jià)生物相容性計(jì)算接種細(xì)胞黏附率評價(jià)親水性接種內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞后行組織學(xué)觀察、掃描電鏡和透射電鏡觀察3內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞接種到脫細(xì)胞兔主動脈構(gòu)建小口徑組織工程血管置入我們自行研制的小口徑組織工程血管生物反應(yīng)器分別給予仿生搏動流體應(yīng)力和靜態(tài)培養(yǎng)后檢測觀察大體形態(tài)行HE染色、MASSON染色和彈力纖維染色掃描電鏡觀察REALTIMEPCR檢測COLLAGENI、III、IV、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和內(nèi)皮素1MRNA表達(dá)免疫熒光檢測鈣調(diào)蛋白、Α肌動蛋白、VIII因子相關(guān)抗原和血管性假性血友病因子NO和6KETOPGF1A濃度檢測血小板黏附實(shí)驗(yàn)生物力學(xué)檢測。2、1分組①動態(tài)培養(yǎng)組②靜態(tài)培養(yǎng)組③動態(tài)培養(yǎng)慢病毒組④靜態(tài)培養(yǎng)慢病毒組⑤動態(tài)培養(yǎng)IGF1RSIRNA組⑥靜態(tài)培養(yǎng)IGF1RSIRNA組。檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡REALTIMEPCR檢測IGF1R、骨橋蛋白MRNAWESTERNBLOT檢測IGF1R、骨橋蛋白、PTYRIGF1R、PAKT2分組①動態(tài)培養(yǎng)組②靜態(tài)培養(yǎng)組。檢測MICRNA芯片檢測MICRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測REALTIMEPCR檢測差異表達(dá)的MICRNA3分組①動態(tài)培養(yǎng)組②靜態(tài)培養(yǎng)組③動態(tài)培養(yǎng)慢病毒組④靜態(tài)培養(yǎng)慢病毒組⑤動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223組⑥靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA223組⑦動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153組⑧靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA153組。檢測靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡REALTIMEPCR檢測IGF1R、骨橋蛋白MRNAWESTERNBLOT檢測IGF1R、骨橋蛋白、PTYRIGF1R、PAKT。結(jié)果1、1平滑肌細(xì)胞成束平行的排列呈典型的“峰與谷”樣生長Α肌動蛋白免疫熒光呈現(xiàn)強(qiáng)陽性內(nèi)皮細(xì)胞呈典型的“鵝卵石”樣生長排列密集VIII因子相關(guān)抗原免疫組化染色為強(qiáng)陽性2①脫細(xì)胞兔主動脈質(zhì)地與新鮮兔主動脈相比無明顯變化②HE染色結(jié)構(gòu)疏松質(zhì)地均勻自身細(xì)胞基本完全脫除MASSON染色結(jié)構(gòu)疏松膠原纖維之間可見較多空隙彈力纖維染色結(jié)構(gòu)疏松彈力纖維之間可見較多空隙③掃描電鏡檢測外表面毛糙主要由粗大的膠原纖維交織而成孔隙比內(nèi)表面多內(nèi)表面光滑④對平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性評價(jià)為01級⑤平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率分別為6432％±203和5277±119⑥種子細(xì)胞脫細(xì)胞兔主動脈復(fù)合物的檢測HE染色平滑肌細(xì)胞生長良好并有部分遷移至管壁內(nèi)部內(nèi)皮細(xì)胞附著于內(nèi)表面生長良好掃描電鏡外表面和內(nèi)表面均被平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞附著并且部分平滑肌細(xì)胞向支架表面的孔隙內(nèi)生長透射電鏡平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)富含肌絲縱向平行排列胞內(nèi)有密斑和密體內(nèi)皮細(xì)胞間存在細(xì)胞連接胞漿內(nèi)可見WP小體⑦親水性浸泡15分鐘后吸水率227±212浸泡12小時(shí)后飽和519±23而后維持在這一水平3①仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的小口徑組織工程血管管腔通暢色澤與天然血管接近②HE染色仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的數(shù)量較靜態(tài)培養(yǎng)的數(shù)量更多③掃描電鏡仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞向鄰近的細(xì)胞伸出很多突起相連靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞沿著支架形成紡錘形狀細(xì)胞數(shù)量也非常少仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管管腔內(nèi)面形成更完整的單層內(nèi)皮細(xì)胞層并更廣泛的分布④彈力纖維染色天然血管和仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中染色較為豐富MASSON染色膠原表達(dá)沒有顯著差異REALTIMEPCR檢測仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞COLLAGENI、III和IV基因表達(dá)水平明顯升高⑤免疫熒光檢測仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中平滑肌細(xì)胞沿環(huán)形方向伸展排列CALPONIN和AACTIN免疫熒光強(qiáng)度更強(qiáng)數(shù)量更多仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中內(nèi)皮細(xì)胞幾乎鋪滿管腔內(nèi)壁VIII因子相關(guān)抗原和血管性假性血友病因子免疫熒光強(qiáng)度更強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量更多⑥REALTIMEPCR檢測仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中堿性成纖維細(xì)胞生長因子和內(nèi)皮素1MRNA的表達(dá)較靜態(tài)培養(yǎng)明顯升高⑦NO和6KETOPGF1A檢測仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管的內(nèi)皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量NO和6KETOPGF1A數(shù)量比靜態(tài)培養(yǎng)更接近天然血管⑧血小板黏附實(shí)驗(yàn)在仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管的管腔內(nèi)面粘附的血小板很少⑨力學(xué)特性仿生搏動流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管的拉伸彈性恢復(fù)率、斷裂伸長率、抗拉強(qiáng)度明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)的血管。2、1①動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)凋亡明顯減弱動態(tài)培養(yǎng)干擾IGF1RMRNA翻譯后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較細(xì)胞增殖明顯減弱凋亡明顯增強(qiáng)②REALTIMEPCR檢測動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1RMRNA的表達(dá)明顯上調(diào)動態(tài)培養(yǎng)干擾IGF1RMRNA翻譯后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1RMRNA的表達(dá)明顯下調(diào)③WESTERNBLOT檢測動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1R、PTYRIGF1R、PAKT的表達(dá)明顯上調(diào)動態(tài)培養(yǎng)干擾IGF1RMRNA翻譯后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1R、PTYRIGF1R、PAKT的表達(dá)明顯下調(diào)2①動態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞組中篩選出2個表達(dá)上調(diào)2倍以上的MICRNA6個表達(dá)下調(diào)2倍以上的MICRNA②REALTIMEPCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證MICRNA153的表達(dá)在動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中約為靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中的12MICRNA223的表達(dá)在動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中約為靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中的14③REALTIMEPCR檢測發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長MICRNA153和MICRNA223的表達(dá)呈下降趨勢并均在4小時(shí)達(dá)到最低此后MICRNA153和MICRNA223的表達(dá)一直維持在最低水平3①EGFPRFP報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示IGF1R是MICRNA153和MICRNA223作用的靶基因并且MICRNA223對靶基因IGF1R的調(diào)控作用強(qiáng)于MICRNA153②REALTIMEPCR檢測靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與靜態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較MICRNA153和MICRNA223的表達(dá)明顯上調(diào)上調(diào)約4倍左右動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與靜態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較MICRNA153和MICRNA223的表達(dá)明顯下調(diào)③動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較細(xì)胞增殖明顯減弱凋亡明顯增強(qiáng)動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較細(xì)胞增殖減弱更加明顯凋亡增強(qiáng)更加明顯④REALTIMEPCR檢測動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1RMRNA的表達(dá)無明顯差異動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1RMRNA的表達(dá)無明顯差異⑤WESTERNBLOT檢測動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153和MICRNA223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1R的表達(dá)明顯下調(diào)動態(tài)培養(yǎng)MICRNA223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞與動態(tài)培養(yǎng)MICRNA153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較IGF1R、PTYRIGF1R、PAKT的表達(dá)下調(diào)更加明顯。結(jié)論1、酶消化法分離內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞方法簡單可行細(xì)胞獲取率高獲得細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和免疫表型符合內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征2、用不使用胰酶的化學(xué)方法制備脫細(xì)胞兔主動脈支架材料方法簡便可行制備的脫細(xì)胞兔主動脈支架材料的親水性、細(xì)胞黏附性、細(xì)胞相容性和組織學(xué)等特性均適合作為小口徑組織工程血管的支架材料3、仿生搏動流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖并引導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的同向排列和內(nèi)皮細(xì)胞的均勻分布可能會引導(dǎo)小口徑組織工程血管形成接近于天然血管的組織結(jié)構(gòu)仿生搏動流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)膠原和彈力纖維的分泌可能會引導(dǎo)小口徑組織工程血管具備接近于天然血管的生物力學(xué)性能仿生搏動流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞成熟表型的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌可能會引導(dǎo)小口徑組織工程血管向天然血管的方向成熟分化仿生搏動流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞舒張血管和抗血栓形成功能的發(fā)揮可能會引導(dǎo)小口徑組織工程血管擁有接近于天然血管的舒張血管和抗血栓形成能力4、IGF1R的表達(dá)上調(diào)、活性及其下游信號通路激活在仿生搏動應(yīng)力促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和減少其凋亡中起重要作用5、仿生搏動應(yīng)力可以促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞IGF1R相關(guān)的MICRNA223和MICRNA153表達(dá)下調(diào)仿生搏動應(yīng)力作用4小時(shí)MICRNA223和MICRNA153下調(diào)幅度最大此后維持在這一表達(dá)水平6、MICRNA223和MICRNA153的表達(dá)下調(diào)在仿生搏動應(yīng)力促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和減少其凋亡中通過上調(diào)IGF1R的表達(dá)、激活其活性及其下游信號通路起重要作用。

簡介：對本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌PET32AGGT進(jìn)行了小試發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化；重組質(zhì)粒PETGGT穩(wěn)定性的鑒定；細(xì)胞固定化生物合成茶氨酸的研究；在30L發(fā)酵罐擴(kuò)大生產(chǎn)工藝的初步研究。主要研究結(jié)果如下1、利用PIACKETTBURMAN實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法進(jìn)行了小試發(fā)酵的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基為葡萄糖1039GL、酵母提取物688GL、K2HPO4710GL、蛋白胨10GL、NACL10GL、MGSO47H2O1GL；優(yōu)化培養(yǎng)條件為初始PH732、培養(yǎng)時(shí)間667H、IPTG誘導(dǎo)溫度3151℃、裝液量50ML250ML、接種量1％、IPTG誘導(dǎo)時(shí)間4H。ΓGGT活性為464UML，茶氨酸的產(chǎn)量為3518GL，L谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為577％。2、該基因工程菌在連續(xù)傳代100代后，質(zhì)粒的目的基因片斷沒有缺失，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；但在無抗生素選擇壓力下，連續(xù)傳代20代后開始出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的細(xì)胞，連續(xù)傳代100代后18％的細(xì)胞含有正常質(zhì)粒，表現(xiàn)出一定的分裂不穩(wěn)定性。該基因工程菌在優(yōu)化培養(yǎng)基和優(yōu)化條件下的整個發(fā)酵過程中，始終表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)和分裂穩(wěn)定性。3、確定了海藻酸鈉20GL固定化后005％戊二醛交聯(lián)的固定化方法，固定化細(xì)胞酶活回收率為792％。細(xì)胞經(jīng)固定化后操作穩(wěn)定性與貯存穩(wěn)定性較游離菌顯著提高。構(gòu)建了固定化細(xì)胞填充床反應(yīng)器，茶氨酸連續(xù)生物合成的平均產(chǎn)量為2540GL，平均體積產(chǎn)率為635GLH。4、初步確立了該基因工程菌發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)的相關(guān)參數(shù)和培養(yǎng)方法30L發(fā)酵罐中加入12L優(yōu)化培養(yǎng)基，5％的接種量，加消泡劑磷酸丁酯5ML，轉(zhuǎn)速250RMIN，37℃發(fā)酵培養(yǎng)，并根據(jù)溶氧變化補(bǔ)料添加葡萄糖，當(dāng)溶氧低于40％補(bǔ)料100ML葡萄塘10GL，滴加5MOLLNAOH控制發(fā)酵PH在73左右，6H后用005MMOLLIPTG誘導(dǎo)，315℃誘導(dǎo)4H。30L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)后該基因工程菌的細(xì)胞密度OD600值可以達(dá)到192，但ΓGGT活性僅為122UML，茶氨酸產(chǎn)量為806GL，L谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率僅為1322％。

簡介：目的通過研究不同代次人髓核細(xì)胞的形態(tài)、增殖活性和表型表達(dá)變化，篩選出組織工程椎間盤研究適宜的種子細(xì)胞，并研究轉(zhuǎn)化生長因子Β1TRANSFMINGGROWTHFACTΒ1，TGFΒ1和胰島素樣生長因子1INSULINLIKEGROWTHFACT1，IGF1對髓核細(xì)胞增殖和表型表達(dá)的影響，探討TGFΒ1和IGF1在組織工程椎間盤研究中的應(yīng)用價(jià)值，通過制備聚乳酸羥基乙酸PLGA三維框架，將種子細(xì)胞與框架結(jié)合，體外構(gòu)建組織工程椎間盤。方法1從人正常和退變髓核組織分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞，分別取不同代次細(xì)胞作為研究對象，通過光鏡和電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，對生長曲線、MTT攝取等進(jìn)行測定，RTPCR方法測定細(xì)胞的聚集蛋白聚糖AGGRECAN、Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白MRNA的表達(dá)，來確定組織工程椎間盤的種子細(xì)胞。2將人正常傳2代髓核細(xì)胞作為研究對象，采用MTT二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽法和RTPCR技術(shù)，探索TGFΒ1和IGF1對細(xì)胞的形態(tài)、增殖以及Ⅱ型膠原和AGGRECAN的調(diào)節(jié)作用，及其時(shí)效與量效的關(guān)系。3將人正常髓核細(xì)胞種植于聚乳酸羥基乙酸PLGA三維多孔框架，構(gòu)建了組織工程椎間盤，通過MTT攝取、激光共聚焦熒光顯微鏡及掃描電鏡的方法進(jìn)行體外觀察。結(jié)果1體外培養(yǎng)條件下，可見退變髓核細(xì)胞排列較紊亂，粗面內(nèi)織網(wǎng)輕度擴(kuò)張。在接種相同的細(xì)胞密度和相同的培養(yǎng)條件下，成人正常和退變髓核細(xì)胞的生長曲線存在差異；二者的MTT攝取在傳1代時(shí)差異均無顯著性P＞005，傳3、5代時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。不同代次正常髓核細(xì)胞比較，傳3代之前細(xì)胞形態(tài)良好，從傳4代起，部分細(xì)胞向長梭形演化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。生長曲線和MTT試驗(yàn)提示傳3代之前的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。RTPCR實(shí)驗(yàn)提示，正常髓核細(xì)胞前3代表達(dá)Ⅱ型膠原和AGGRECAN旺盛，從傳4代起開始減少，其中AGGRECAN減少更明顯；退變髓核細(xì)胞不僅表達(dá)Ⅱ型膠原和AGGRECAN，而且表達(dá)少量Ⅰ型膠原。2在1％血清條件下，TGFΒ1具有促增殖作用。在10％血清條件下，TGFΒ1和IGF1均能提高細(xì)胞的增殖活性，并且在各自一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。二者聯(lián)合應(yīng)用作用效果更顯著。10UGL、100UGLTGFΒ1組和100UGLIGF1在促進(jìn)AGGRECAN和Ⅱ型膠原基因表達(dá)方面也作用顯著，其中，10UGL組TGFΒ1作用最明顯。3細(xì)胞種植于PLGA框架后，行MTT攝取實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞框架復(fù)合體呈深藍(lán)著色，縱行剖開，可見藍(lán)色晶體均勻分布于整個材料支架內(nèi)部。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察可見大量紅色熒光著色的細(xì)胞貼附于支架結(jié)構(gòu)內(nèi)，掃描電鏡可見大量細(xì)胞貼附于支架內(nèi)，并可見少量細(xì)胞外基質(zhì)分泌。結(jié)論1本研究提示成人正常髓核細(xì)胞傳代后前3代細(xì)胞形態(tài)良好，增殖能力強(qiáng)，AGGRECAN和Ⅱ型膠原MRNA表達(dá)良好，適合作為組織工程椎間盤的種子細(xì)胞，而退變髓核細(xì)胞由于細(xì)胞活性較低，表型表達(dá)發(fā)生改變，不宜作為種子細(xì)胞。2TGFΒ1和IGF1對人正常髓核細(xì)胞具有維持形態(tài)、促進(jìn)增殖和正常表型表達(dá)的作用，其中10UGLTGFΒ1和100UGLIGF1作用最顯著。3以人正常髓核細(xì)胞作為種子細(xì)胞，以PLGA作為三維框架，二者復(fù)合后細(xì)胞能夠在支架材料內(nèi)貼附、生長，為進(jìn)一步體內(nèi)修復(fù)研究奠定良好的基礎(chǔ)。

簡介：如何構(gòu)建具有仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)ECM結(jié)構(gòu)和功能的組織工程支架，一直是組織工程及再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。區(qū)別于傳統(tǒng)紡絲，靜電紡絲是一種使帶電荷的聚合物溶液或熔體在靜電場中射流來制備聚合物納米級纖維的加工方法。以此技術(shù)制備的納米纖維支架，具有極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，相對于傳統(tǒng)技術(shù)制備的材料支架能夠更好地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?；陟o電紡絲技術(shù)的納米纖維有望成為理想的組織工程支架。生物相容性可以解釋為生物材料和人體組織接觸后，在材料組織界面發(fā)生一系列相互作用后最終被人體組織所接受的性能，生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題。細(xì)胞培養(yǎng)法因其檢測生物相容性快速、簡便、重復(fù)性好又價(jià)廉的特點(diǎn)，在材料生物相容性評價(jià)中起著越來越重要的作用。本課題對基于靜電紡絲技術(shù)組織工程支架的生物相容性進(jìn)行了初步研究。采用靜電紡絲技術(shù)制備了新型的有別于傳統(tǒng)技術(shù)的組織工程支架仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)EXTRACELLULARMATRIX，ECM，如絲素蛋白靜電紡絲支架，殼聚糖膠原蛋白靜電紡絲復(fù)合支架等，MTT法檢測細(xì)胞粘附和增殖，SEM形態(tài)學(xué)觀察，在整體和細(xì)胞水平基礎(chǔ)上深入至分子水平，使用RTPCR分析了材料對內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。主要研究內(nèi)容與結(jié)論如下以六氟異丙醇為溶劑，采用靜電紡絲制備絲素蛋白納米纖維，體外接種內(nèi)皮細(xì)胞，MTT法結(jié)果顯示納米纖維能夠有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和增殖。共培養(yǎng)1D、3D、5D和7D后，對照組內(nèi)皮細(xì)胞增殖3倍，材料組細(xì)胞增殖也達(dá)27倍。RTPCR檢測到PCNA在實(shí)驗(yàn)材料組和對照組的細(xì)胞中均有表達(dá)，與MTT增殖結(jié)果相符。結(jié)果表明，基于靜電紡絲技術(shù)的絲素蛋白支架具有良好的生物相容性。從仿生角度出發(fā)，通過對生物相容性良好的天然材料殼聚糖和膠原蛋白的靜電紡絲來從結(jié)構(gòu)和功能上仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)。以六氟異丙醇三氟乙酸為共混溶劑，成功制備出了殼聚糖膠原蛋白復(fù)合支架。發(fā)現(xiàn)隨著混合體系中殼聚糖含量的增加，靜電紡納米纖維的直徑呈減小趨勢。選用戊二醛GA、水溶性碳二亞胺型縮合劑EDC、熱交聯(lián)以及紫外照射UVIRRADIATION交聯(lián)等方式對支架預(yù)處理，SEM照片顯示經(jīng)GA交聯(lián)后濕態(tài)條件殼聚糖膠原蛋白復(fù)合支架仍然保持纖維形態(tài)，交聯(lián)效果明顯，滿足了其保持納米纖維結(jié)構(gòu)以仿生組織細(xì)胞外基質(zhì)ECM的需要。生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題，采用細(xì)胞培養(yǎng)法對殼聚糖膠原蛋白復(fù)合支架的生物相容性進(jìn)行研究。HE染色后可清晰看到內(nèi)皮細(xì)胞在材料表面貼附牢固，外形飽滿，具有良好的生長狀態(tài)。SEM顯示細(xì)胞可進(jìn)入三維網(wǎng)絡(luò)狀纖維內(nèi)部孔隙，呈現(xiàn)立體遷移生長。MTT法結(jié)果表明，殼聚糖膠原蛋白質(zhì)量比2080、5050材料組表現(xiàn)出較其它3組更好的細(xì)胞粘附與增殖能力。RTPCR檢測細(xì)胞ICAM1、PCNA以及P53基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在管家基因Β2MICROGLOBULINB2M表達(dá)水平較一致的情況下，各個基因的表達(dá)水平是有差異的；就同一基因表達(dá)而言，殼聚糖膠原蛋白各組相互之間表達(dá)差異并不明顯，且與TCP相比亦無明顯差異。結(jié)果表明，基于靜電紡技術(shù)的殼聚糖膠原蛋白復(fù)合支架具有良好的生物相容性。

簡介：靜電紡絲技術(shù)是現(xiàn)階段一種制備數(shù)十到數(shù)百納米纖維的有效方法。由于生物高分子具有良好的生物相容性，近年來國內(nèi)外都對生物高分子的靜電紡絲做了大量的研究。靜電紡生物高分子在組織工程支架、組織修復(fù)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)通過靜電紡絲的方法制備明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜，并通過SEM、FTIR、XRD、熱分析、接觸角、力學(xué)性能測試分析該納米纖維的各項(xiàng)物理、化學(xué)性能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該復(fù)合纖維的直徑隨著透明質(zhì)酸在復(fù)合體系中的比例的增加而增大；在復(fù)合比例相同時(shí)，直徑隨著溶液總質(zhì)量體積比的遞增而逐漸增大。隨著透明質(zhì)酸的含量的增加，熱穩(wěn)定性下降，但親水性和力學(xué)性能均有所提高。為了提高靜電紡明膠透明質(zhì)酸纖維的耐水性和穩(wěn)定性，出于對生物毒性的考慮選用碳化二亞胺EDC作為交聯(lián)劑，并對交聯(lián)后的明膠透明質(zhì)酸納米纖維的性能進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過交聯(lián)的復(fù)合纖維，直徑較交聯(lián)前有所增大。交聯(lián)后纖維的脫水溫度、脫水過程的焓變、接觸角和應(yīng)力都較交聯(lián)前有所提高。通過這些測試，我們對明膠透明質(zhì)酸復(fù)合纖維交聯(lián)前后的物理、化學(xué)性質(zhì)有了基本了解，為后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。通過在共混明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜上種植成纖維、內(nèi)皮細(xì)胞，用MTT法檢測細(xì)胞的黏附與增殖情況，在體外評價(jià)材料的生物相容性。通過HE染色和SEM來檢測細(xì)胞在纖維膜上的生長形態(tài)。黏附實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞在材料上能很好的黏附。增殖實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞在各種比例的納米纖維材料上的增殖情況都要好于對照組玻片，隨著時(shí)間的增長，細(xì)胞的量明顯增多。HE染色和SEM結(jié)果顯示細(xì)胞在纖維膜上能保持良好的細(xì)胞形態(tài)。明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜能為細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境，未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。利用靜電紡明膠透明質(zhì)酸納米纖維膜作為皮膚敷料植入SD大鼠體內(nèi)，通過外表觀察和HE染色檢測纖維膜在動物體內(nèi)的生物相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，纖維膜植入SD大鼠體內(nèi)，和空白對照組具有相似的表面形態(tài)，同時(shí)均有巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，一周以后都有大量的毛細(xì)血管產(chǎn)生，三周后上皮形成較完整。對傷口面積的測量顯示，兩周以后，植入纖維膜的傷口愈合面積更大。通過對明膠透明質(zhì)酸納米纖維的表征測試和生物相容性的評價(jià)說明明膠透明質(zhì)酸納米纖維可以作為良好的生物材料用于組織工程支架的構(gòu)建。

簡介：大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文生物反應(yīng)器內(nèi)成骨細(xì)胞的擴(kuò)增和組織工程骨的構(gòu)建姓名宋克東申請學(xué)位級別博士專業(yè)化學(xué)工程指導(dǎo)教師劉天慶崔占峰20060501生物反應(yīng)器內(nèi)成骨細(xì)胞的擴(kuò)增和組織工程骨的構(gòu)建性能檢測，并對培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)代謝情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在RWHMB內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞生長良好，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)；中空纖維膜亦表現(xiàn)出良好的生物相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)RWHMB能結(jié)合RWVB和中空纖維膜的優(yōu)點(diǎn)，較好的模擬體內(nèi)環(huán)境，對所培養(yǎng)的細(xì)胞施加適當(dāng)?shù)牧黧w應(yīng)力刺激，促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝和物質(zhì)交換，更有利于細(xì)胞的生長及增殖。利用擴(kuò)增出的成骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，將其分別以2LO％ELLS／ML和1106CELLS／ML兩種密度接種到生物衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)進(jìn)行三維組織工程骨的構(gòu)建。對所構(gòu)建的骨組織分別進(jìn)行倒置顯微鏡INVERTEDMICROSCOPE、掃描電鏡SEM、堿性磷酸酶舢LPL、礦化結(jié)構(gòu)和AO／EB雙重?zé)晒馊旧壬飳W(xué)性能檢測，并對培養(yǎng)過程的營養(yǎng)物質(zhì)代謝情況進(jìn)行監(jiān)控和分析。結(jié)果顯示以這兩種密度接種在RWVB中培養(yǎng)的骨組織生長良好，能分泌大量膠原纖維，并有礦化基質(zhì)和新骨樣組織形成。通過RWVB內(nèi)部流體對流所產(chǎn)生的應(yīng)力刺激，可提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性表達(dá)，并加速礦化結(jié)節(jié)的形成，從而完成成骨細(xì)胞的快速增殖與分化以及工程化組織的三維構(gòu)建。為進(jìn)一步探索骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的方法，用經(jīng)綠色熒光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP標(biāo)記的新西蘭兔顱骨來源的成骨細(xì)胞復(fù)合到生物衍生骨支架材料上，在RWVB內(nèi)三維構(gòu)建組織工程骨，同時(shí)與靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構(gòu)建的組織工程骨進(jìn)行比較。每12小時(shí)取樣一次，分別進(jìn)行乳酸、葡萄糖、PH的測定，一周后取出標(biāo)本通過掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)、染色體倍體分析等手段比較利用RWVB構(gòu)建的組織工程骨與靜態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程骨的差異。結(jié)果顯示RWVB中以兩種密度接種和構(gòu)建的組織生長良好，細(xì)胞仍保持正常的細(xì)胞周期和染色體形態(tài)，并且RWVB中的構(gòu)建物的細(xì)胞擴(kuò)增是靜態(tài)培養(yǎng)的5倍。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的現(xiàn)實(shí)可行性。對三維構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)新西蘭兔橈骨大段骨缺損進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)研究。制作新西蘭兔橈骨中段15MM骨缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組，實(shí)驗(yàn)組植入經(jīng)RWVB構(gòu)建的組織工程骨、對照組植入靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中構(gòu)建的組織工程骨、空白組僅植入空白的生物衍生骨支架材料。術(shù)后對動物進(jìn)行大體觀察、X攝線觀察各組不同時(shí)期骨缺損的修復(fù)情況，并于術(shù)后4周和8周取出骨缺損區(qū)分別進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)切片觀察和圖像分析新生骨的面積值。結(jié)果顯示術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組的骨缺損幾乎完全修復(fù)，在三組中效果最好。空白組術(shù)后8周缺損區(qū)僅僅充滿纖維和結(jié)締組織。在RWVB構(gòu)建的生物衍生骨支架與成骨細(xì)胞的復(fù)合物具有很好的修復(fù)大段骨缺損的能力?？傊?，本研究確定了在RWVB和RWHMB中擴(kuò)增骨組織工程種子細(xì)胞的最佳工藝和操作參數(shù)，明確了這兩種反應(yīng)器都可以提供低剪切力的培養(yǎng)環(huán)境，而且細(xì)胞之間有三維聯(lián)系的機(jī)會，成骨細(xì)胞表現(xiàn)出良好的體外擴(kuò)增能力，適于建立一種理想的成骨細(xì)胞體外擴(kuò)增的三維培養(yǎng)體系，并且中空纖維膜可以作為一種改進(jìn)的載體用于骨組織工程種子細(xì)

簡介：第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文分類號密級國際十進(jìn)分類號（UDC）第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文人胎盤來源干細(xì)胞的生物學(xué)性狀檢測及人胎盤來源干細(xì)胞的生物學(xué)性狀檢測及用于構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究用于構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究（題名和副題名）劉大順劉大順（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名指導(dǎo)教師姓名邱建華邱建華教授（主任醫(yī)師）教授（主任醫(yī)師）指導(dǎo)教師單位指導(dǎo)教師單位第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科申請學(xué)位級別申請學(xué)位級別博士博士專業(yè)名稱專業(yè)名稱耳鼻咽喉科學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)論文提交日期論文提交日期200904答辯日期答辯日期200905論文起止時(shí)間論文起止時(shí)間2007年2月至月至2009年4月學(xué)位授予單位學(xué)位授予單位第四軍醫(yī)大學(xué)第四軍醫(yī)大學(xué)第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文人胎盤來源干細(xì)胞的生物學(xué)性狀檢測人胎盤來源干細(xì)胞的生物學(xué)性狀檢測及用于構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究及用于構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究研究生劉大順研究生劉大順學(xué)科專業(yè)耳鼻咽喉科學(xué)學(xué)科專業(yè)耳鼻咽喉科學(xué)所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻喉科所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻喉科導(dǎo)師邱建華師邱建華教授（主任醫(yī)師）教授（主任醫(yī)師）關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞人胎盤來源干細(xì)胞；組織工程；軟骨；分化；人胎盤來源干細(xì)胞；組織工程；軟骨；分化；中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)2009年05月

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簡介：本論文以基因工程菌PICHIAPASTIS高密度發(fā)酵獲得的重組人源膠原蛋白RECOMBINANTHUMANSOURCECOLLAGEN，RHSC為主要研究對象，對其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)表征，并與殼聚糖復(fù)合，通過冷凍干燥技術(shù)制備三維多孔狀海綿支架。選擇具有強(qiáng)抗氧化活性的原花青素PROANTHOCYANIDINS，PA作為交聯(lián)劑，以期提高支架的各方面特性。1通過分離純化獲得的RHSC達(dá)到電泳純，測試顯示純度＞99％，回收率＞93％。采用DSC，紫外光譜，紅外光譜和NMR對RHSC進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并與標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ型膠原蛋白比對，確定RHSC具有Ⅲ型膠原蛋白的特征結(jié)構(gòu)。2通過改變殼聚糖重組人源膠原蛋白海綿基質(zhì)制備過程中的因素發(fā)現(xiàn)，醋酸的濃度和殼聚糖與RHSC的質(zhì)量比是影響微觀結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵因素。通過PA交聯(lián)作用制備的海綿成品具有良好的理化性質(zhì)，其內(nèi)部孔徑約為110160ΜM，孔隙率＞92％，吸水率約為3900％紅外光譜測試發(fā)現(xiàn)，PA與海綿基質(zhì)可以形成穩(wěn)定的氫鍵DSC和TG分析顯示通過交聯(lián)作用，海綿的熱穩(wěn)定性提高體外酶解實(shí)驗(yàn)表明，交聯(lián)后海綿的抗酶解能力增強(qiáng)。對海綿進(jìn)行生物相容性研究，內(nèi)容包括細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和細(xì)胞形態(tài)等方面，結(jié)果顯示海綿支架具有較好的細(xì)胞相容性。PA交聯(lián)的殼聚糖重組人源膠原蛋白海綿是一種理化性質(zhì)良好的生物材料，對細(xì)胞的黏附、生長和增殖都有一定的促進(jìn)作用，盡管目前還處于實(shí)驗(yàn)研究階段，但有望進(jìn)一步應(yīng)用于組織工程化器官的研究以及臨床的應(yīng)用。

簡介：浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文生物功能化梳狀聚乙二醇改性組織工程材料表面的研究姓名浦鳴申請學(xué)位級別碩士專業(yè)材料學(xué)指導(dǎo)教師計(jì)劍20060301浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文向自由能低的表面遷移。細(xì)胞黏附率，增殖率，MTR活性以及掃描電鏡觀察的研究結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞在2％的CPEG共混改性PLA材料上的細(xì)胞黏附和增殖有所改善，而含量為8％和15％的CPEG在自遷移過程中由于其體積排斥效應(yīng)阻抗了細(xì)胞的黏附和增殖。關(guān)鍵詞組織工程梳狀NLN；表面自遷移；仿生；細(xì)胞相容性；血液相容性；原子轉(zhuǎn)移自由基聚合ATRPTI

簡介：點(diǎn)擊查看更多智能化組織工程組織仿生培育系統(tǒng)的研制及壓應(yīng)力對組織工程骨中MSCs生物學(xué)作用的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文可降解骨組織工程支架生物相容性及其復(fù)合RHBMP2后成骨效能的研究姓名李軼申請學(xué)位級別碩士專業(yè)口腔頜面外科指導(dǎo)教師冉煒20040520中山大學(xué)碩十學(xué)位論文可降解骨組織工程支架生物相容性駛北復(fù)合RHBMP．2后成骨效能的研究體標(biāo)本、組織學(xué)觀察體內(nèi)異位成骨隋況。20只成年新西蘭兔雙側(cè)下頜骨下緣形成15MMX6MM全層骨質(zhì)缺損，然后將復(fù)合RHBMP一2的支架材料植入一側(cè)缺損，未復(fù)合RHBMP一2的支架材料植入另一側(cè)作為陰性對照。術(shù)后2周、4周、8周、L2周取材行大體標(biāo)本、X片觀察、組織學(xué)觀察、電鏡觀察及計(jì)算機(jī)圖像分析。結(jié)果①新型骨組織工程支架A、B、C與對照材料D均系多IL支架材料，平均孔隙率80～85％，微孔直徑分布在200～3001JM，大孔附壁上有小孔，其問有相互貫通的微孔，表面粗糙O發(fā)現(xiàn)支架材料A、B、C與對照材料D相比，支架材料C生物相容性好，同期成骨量最大。支架材料A、B組出現(xiàn)明顯的異物肉芽腫反應(yīng)。O復(fù)合RHBMP一2的支架材料C植入背部肌袋里2周后發(fā)現(xiàn)材料有少量降解并被纖維組織包繞、間充質(zhì)細(xì)胞聚集、炎癥反應(yīng)輕微。4周后材料進(jìn)一步降解并見類骨質(zhì)、軟骨組織以及纖細(xì)的骨小梁形成。8周見骨組織進(jìn)一步成熟。對照組始終無骨組織形成；復(fù)合RHBMP一2的支架材料C修復(fù)缺損成骨時(shí)間早，成骨面積多，血管增生明顯，同期成骨量大。在缺損邊緣區(qū)可見新生骨從斷端向中央網(wǎng)孔內(nèi)生長，包括膜內(nèi)成骨、軟骨成骨和直接成骨；缺損中央?yún)^(qū)可見直接成骨呈多中心成骨。至12周時(shí)缺損基本修復(fù)。對照側(cè)未見多中心成骨現(xiàn)象，缺損未能完全修復(fù)。術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組和對照組材料均有殘留。結(jié)論①支架材料C生物相容性好，成骨效果優(yōu)于對照材料D，是一種較為理想的骨組織工程生物支架材料。支架材料A、B不適宜作為骨組織工程生物支架材料；⑦支架材料C復(fù)合RHBMP一2后植入體內(nèi)有較強(qiáng)的異位成骨能力，是BMP的良好載體；O支架材料C在體內(nèi)具有傳導(dǎo)骨形成功能，復(fù)合RHB船2后有誘導(dǎo)一傳導(dǎo)雙重功能，是一種很有前途的骨組織支架材料。但是由于其本身的生物力學(xué)及降解速度方面的缺陷，使其應(yīng)用受到限制，故需要更深入的研究。關(guān)鍵詞骨組織工程支架；頜骨缺損；異位成骨；骨形成蛋白；兔；

簡介：人機(jī)工程仿真分析能夠在設(shè)計(jì)早期對產(chǎn)品的人機(jī)因素進(jìn)行分析和評價(jià)，利用計(jì)算機(jī)建立人體和機(jī)器的計(jì)算模型，融入人體生理特征，模擬人操作機(jī)器的各種動作，進(jìn)而將人、機(jī)相互作用的動態(tài)過程可視化，通過結(jié)合人機(jī)工程學(xué)的各種評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和算法，對產(chǎn)品機(jī)的人機(jī)因素進(jìn)行量化分析和評價(jià)。人機(jī)工程仿真分析一方面可以大大降低產(chǎn)品開發(fā)的成本，為產(chǎn)品創(chuàng)新提供強(qiáng)有力的支持；另一方面，可以大大降低一些危險(xiǎn)性產(chǎn)品的測試風(fēng)險(xiǎn)。虛擬人體模型是人機(jī)工程仿真分析的核心，它作為真實(shí)人體的替身，是檢驗(yàn)和分析產(chǎn)品設(shè)計(jì)方案中人機(jī)工程性能的關(guān)鍵?，F(xiàn)有人體模型在人體數(shù)據(jù)支持，模型精度以及功能應(yīng)用等方面都存在很多缺陷，使其無法滿足越來越高級、復(fù)雜的人機(jī)工程分析、評價(jià)算法的需要。論文以人機(jī)工程仿真設(shè)計(jì)、分析、評價(jià)為目的，建立了由幾何模型、運(yùn)動模型、內(nèi)力模型和外力模型四部分組成的虛擬人體生物力學(xué)模型，并圍繞上述需求展開相關(guān)理論、技術(shù)和方法的研究工作。論文首先討論了面向人機(jī)工程仿真的人體幾何模型的建模方法，從人體解剖學(xué)出發(fā)，通過對人體的動、靜態(tài)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)化，以及對關(guān)節(jié)運(yùn)動約束機(jī)制的改進(jìn)，使模型具有更詳盡的人體數(shù)據(jù)咨詢能力；為了更好地支持肌肉的生物力學(xué)分析，探討了骨骼肌的幾何建模方法。針對人機(jī)交互過程中上述幾何模型的運(yùn)動建模問題，論文給出了兩種互補(bǔ)的方法。一種方法是對傳統(tǒng)的基于逆向運(yùn)動學(xué)的改進(jìn)，以快速、有效地調(diào)整人體姿勢為目的，給出了基于人體生理約束的IK算法及基于時(shí)空約束的IK改進(jìn)算法；另一種方法以運(yùn)動捕獲技術(shù)為基礎(chǔ)，針對簡單骨骼到復(fù)雜骨骼的運(yùn)動重定向情況，提出了新概念及新方法來處理重定向過程中產(chǎn)生的關(guān)節(jié)冗余問題。從而達(dá)到精確地再現(xiàn)人體動作，保證人機(jī)分析的準(zhǔn)確性的目的。為了對骨及關(guān)節(jié)的受力情況進(jìn)行人機(jī)分析，論文建立了針對人體各環(huán)節(jié)的骨及關(guān)節(jié)的外力和扭矩的求解模型，亦稱為外力模型。以多剛體簡化模型和人體生物力學(xué)參數(shù)為建模基礎(chǔ)，以逆向動力學(xué)及多剛體系統(tǒng)動力學(xué)為理論依據(jù)，針對動、靜態(tài)兩種情況，分別給出了基于生物力學(xué)的外力求解模型。以實(shí)現(xiàn)肌肉施力分析為目的，論文討論了肌肉在動、靜性收縮兩種情況下，人體表面骨骼肌的肌肉力預(yù)測模型，文中亦稱為內(nèi)力模型。根據(jù)大腦控制肌肉的最優(yōu)化原則，采用有約束最優(yōu)化方法，對靜性收縮情況，分別建立人體系統(tǒng)的平衡約束方程和肌肉的約束方程，并將其作為約束條件進(jìn)行優(yōu)化求解；對動性收縮情況，則由偽速度形式的拉格朗日動力學(xué)方程推導(dǎo)出等式約束方程以及應(yīng)用HILL三元素模型推導(dǎo)出不等約束方程。通過對約束方程的改進(jìn)，進(jìn)一步提高了該模型的精度。最后，開發(fā)了一個面向人機(jī)工程仿真分析的原型系統(tǒng)ZJUERGOMAN，作為對本文核心內(nèi)容及算法的驗(yàn)證平臺。在第七章中，結(jié)合筆記本電腦桌的設(shè)計(jì)實(shí)例進(jìn)一步驗(yàn)證了本文模型的有效性。

簡介：人骨是一種結(jié)締組織，主要是由生物磷灰石和骨膠原纖維構(gòu)成。其中羥基磷灰石（HA）是人體硬組織，如骨骼和牙齒的主要無機(jī)成分，它為硬組織提供很好的剛性；骨膠原纖維是一種天然高分子，它賦予骨良好的柔韌性和優(yōu)異的生物活性。從材料學(xué)角度而言，大自然把有機(jī)物與無機(jī)物互相巧妙而緊密地結(jié)合起來形成骨，滿足了骨的生物學(xué)和力學(xué)要求。多年來，人們一直試圖通過將無機(jī)非金屬材料和有機(jī)高分子材料復(fù)合，制備多級結(jié)構(gòu)納米材料來模仿天然骨。人工合成的HA成分和結(jié)構(gòu)與骨相似，具有優(yōu)良的生物相容性和骨傳導(dǎo)，廣泛應(yīng)用于骨科。左旋聚乳酸（PLLA）作為一種性能優(yōu)異的可降解高分子材料，已被美國食品藥品管理局（FDA）許可應(yīng)用于臨床，在藥物控釋和組織修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。將納米HA（NHA）與可降解的PLLA復(fù)合可以將HA的成骨性能與PLLA的生物相容性結(jié)合，獲得性能優(yōu)異的復(fù)合材料。但還存在諸如HA納米顆粒分散性不好，HA與PLLA界面相容性差，易相分離，植入體內(nèi)后骨結(jié)合能力不理想等問題，已經(jīng)成為制約其最終應(yīng)用的一個關(guān)鍵因素。NHAPLLA復(fù)合材料的制備方法還有很大的研究空間，通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行可靠的統(tǒng)計(jì)分析，有助于研制具有更好的力學(xué)性能、生物相容性和成骨性的復(fù)合材料。本文從HA納米粒子表面改性出發(fā)，設(shè)計(jì)并制備了改性NHAPLLA組織工程支架，并通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對材料的性能進(jìn)行了研究，主要內(nèi)容如下采用表面接枝聚（Γ芐基L谷氨酸）（PBLG）的改性NHA（PBLGGHA）與PLLA復(fù)合，獲得新型HAGPBLGPLLA納米復(fù)合材料。通過對HA表面化學(xué)改性，有效改善了NHA在氯仿溶液中的均勻分散性，實(shí)現(xiàn)了HA表面從親水性到疏水性的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而可以增強(qiáng)HA與PLLA基體的相互作用。采用相分離技術(shù)制備了具有三維多孔結(jié)構(gòu)的組織工程支架，其孔隙率在85％以上，孔徑在30200ΜM，具有大孔小孔共存的多級結(jié)構(gòu)。通過觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCS）形態(tài)及其細(xì)胞增殖狀況，對成骨細(xì)胞在支架表面的粘附、生長和增殖的情況進(jìn)行探究；通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR（RTPCR）實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)；通過對鼠顱骨和股骨缺損進(jìn)行體內(nèi)修復(fù)實(shí)驗(yàn)，考察材料的骨修復(fù)效果及其臨床應(yīng)用潛能。研究結(jié)果表明，PBLGGHAPLLA復(fù)合材料由于加入了NHA，其細(xì)胞粘附、生長、增殖和以及I型膠原（COLI）等成骨相關(guān)基因的表達(dá)明顯上調(diào)；三維支架材料的生物學(xué)性能和動物骨骼修復(fù)效果明顯優(yōu)于HAPLLA復(fù)合材料和PLLA高分子材料；體外實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)PBLGGHA在復(fù)合材料中比重為10時(shí)，體外誘導(dǎo)BMSCS成骨向分化的能力最強(qiáng)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)ΜCT、HE染色和I型膠原蛋白（COLI）免疫組化結(jié)果顯示，PBLGGHAPLLA組織工程支架的骨生成性能明顯增高；利用TRAP染色評價(jià)不同支架對于破骨細(xì)胞數(shù)及染色濃度的影響，觀察到處理組間染色濃度和破骨細(xì)胞數(shù)沒有顯著差別，而空白對照組表面的破骨細(xì)胞數(shù)量更多。與文獻(xiàn)相比，在HA表面改性方面的文獻(xiàn)多數(shù)集中于改善其浸潤性，而對改性HA的生物性能卻較少關(guān)注。本文的主要創(chuàng)新在于材料結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面在充分考慮到界面物理性能的同時(shí)，又兼顧了材料的生物性能的提高，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了物理性能和生物性能的改善；此外，本文所采用的改性方法在室溫即可完成，同時(shí)適用于多種氨基酸單體的聚合及材料表面改性的處理，具有很好的普適性。另外，本文深入研究了PBLGGHAPLLA納米復(fù)合材料的生物相容性、成骨活性，為新材料的制備和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)證明PBLGGHAPLLA支架具有良好的成骨性，有望作為一種新的骨組織修復(fù)材料在臨床中取得應(yīng)用。

簡介：當(dāng)前臨床上出現(xiàn)了大量針對傳統(tǒng)抗生素的耐藥細(xì)菌株和一些強(qiáng)致病性病毒毒株，人類健康常常受到病原微生物的威脅。面對感染防治的嚴(yán)峻形勢，我們不得不努力尋找新型的抗感染物質(zhì)。經(jīng)過近二十年的研究，發(fā)現(xiàn)在植物、昆蟲和包括人在內(nèi)的高等動物機(jī)體內(nèi)存在近千種內(nèi)源性陽離子肽防御素DEFENSIN。具有活性的防御素分子一般為3～6KD，多數(shù)分子內(nèi)存在6～8個保守半胱氨酸殘基形成的3～4對鏈內(nèi)二硫鍵外，還富含精氨酸、脯氨酸等特殊殘基，整個分子在中性溶液中帶正電荷；晶體衍射揭示防御素分子具有Α螺旋、Β折疊、二硫鍵橋、無規(guī)卷曲等單種或多種二級結(jié)構(gòu)所形成的單體或多聚體空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)二硫鍵等結(jié)構(gòu)的組成方式，防御素被分為Α、Β和Θ等類型。研究已證實(shí)，有805種防御素不僅具有快速、強(qiáng)效地殺滅多種細(xì)菌的活性，并且還具有不誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株的特性；有261種防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋體的作用；有48種防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有54種防御素可產(chǎn)生抗癌細(xì)胞的生物效應(yīng)。此外，防御素作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與了免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能。因此，防御素成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。生物學(xué)家們認(rèn)為防御素可能成為一種新型的抗生素，在作為抗感染制劑、食品防腐劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。國外有數(shù)家制藥公司在進(jìn)行防御素的開發(fā)研究，但因防御素分子太小、含特殊氨基酸較多及具有的抗微生物活性等原因，目前制約防御素產(chǎn)品走上市場的主要瓶頸依然是尚未建立成本低廉、高效穩(wěn)定的制備工藝。人Α防御素5是由小腸潘氏細(xì)胞、泌尿生殖道粘膜等上皮細(xì)胞中表達(dá)的一種生物活性肽。通過對組織提取和化學(xué)合成肽的活性檢測發(fā)現(xiàn)人Α防御素5既可以高效殺滅多種細(xì)菌，又具有抗病毒的生物活性。基于人Α防御素5在小腸隱窩上皮細(xì)胞中組成性或誘導(dǎo)性高表達(dá)的特點(diǎn)和腸道是人體最大內(nèi)源性感染病原菌貯存庫的關(guān)聯(lián)性，我們認(rèn)為Α防御素5是感染防治研究的重要靶分子。因人Α防御素5的組織提取和化學(xué)合成存在產(chǎn)量低、成本高等問題，所以基因工程制備應(yīng)該是獲得大量活性肽的理想途徑。鑒于缺乏制備重組防御素相關(guān)工藝報(bào)道的現(xiàn)狀，為滿足腸道損傷修復(fù)與抗感染等研究的需求，本課題率先探索了人Α防御素5的生物工程制備過程及重組產(chǎn)品的生物活性?，F(xiàn)將研究中所采用的主要方法、獲得的主要結(jié)果和結(jié)論簡述如下1DEFA5基因的克隆與生物信息學(xué)分析采用RTPRC技術(shù)，從經(jīng)LPS誘導(dǎo)表達(dá)的LOVO細(xì)胞總RNA中克隆出DEFA5的閱讀框序列，并構(gòu)建PUCMTDEFA5重組載體。利用DNASTAR、ANTHEPROT50等生物學(xué)軟件與信息平臺分析了DEFA5的信號肽、生化性質(zhì)等特點(diǎn)，篩選出生物活性可能最強(qiáng)的MHD5序列。2重組原核表達(dá)載體及其表達(dá)工程菌株的構(gòu)建基于第一章所獲得的MHD5序列和有關(guān)DEFA5的信息，模擬DEFA5信號肽與前片段的性質(zhì)，篩選并克隆用于融合表達(dá)的承載分子MTRXA、TRXA和MALE的序列及其表達(dá)載體；同時(shí)，根據(jù)表達(dá)載體的特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增出帶有不同克隆位點(diǎn)的MHD5片段，分別構(gòu)建了PQEMHD5、PQEMTRXAMHD5、PETMHD5和PMALMHD5表達(dá)載體及PQEMHD5M15、PQEMTRXAMHD5M15、PETMHD5ROSETTAGAMIB和PMALMHD5BL21等工程菌株。3融合蛋白和RMHD5的表達(dá)、純化與活性檢測經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了MTRXAMHD5包涵體蛋白MW17135724DA和TRXAMHD5MW20646552DA、MALEMHD5MW48602468DA2種可溶性融合蛋白的高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的比例分別為40％、269％和267％，融合蛋白中目的肽所占百分比分別為212％、174％和74％。分別采用親和層析、離子交換層析等不同策略對3種融合蛋白進(jìn)行純化、裂解與鑒定。從MALEMHD5酶解體系中分離純化獲得267MG重組目的肽，并證實(shí)對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923均具有抗菌活性。4酵母表達(dá)載體的構(gòu)建利用LETO軟件優(yōu)化出酵母細(xì)胞偏好的MHD5密碼子，并設(shè)計(jì)合成1對長鏈引物，采用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增MHD5優(yōu)化序列DNA。成功構(gòu)建含有MHD5天然序列和優(yōu)化序列的酵母表達(dá)載體PPIC9KNMHD5和PPIC9KOMHD5。5高拷貝轉(zhuǎn)化酵母克隆的篩選與發(fā)酵工藝的建立選用SACⅠ限制性內(nèi)切酶線型化重組表達(dá)質(zhì)粒，利用載體與GS115酵母菌株基因組在5’AOX區(qū)進(jìn)行單交換同源重組可產(chǎn)生多拷貝外源基因整合的原理，采用電擊轉(zhuǎn)化、篩選和再次電擊轉(zhuǎn)化的方法，將多拷貝目的基因整合到酵母細(xì)胞基因組中。通過PCR鑒定、G418抗性篩選和表型鑒定，分別獲得了可耐受8MGMLG418，表型為HISMUT的5株P(guān)PIC9KOMHD5GS115高拷貝轉(zhuǎn)化克隆005007008009010和3株P(guān)PIC9KNMHD5GS115高拷貝轉(zhuǎn)化克隆N06、N08、N09。挑選O05、O08、O09、N06、N08和N096株克隆在搖瓶中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，采用RTPCR技術(shù)鑒定所挑選的6株克隆均能在MRNA水平上成功表達(dá)目的肽的基礎(chǔ)上，采用WESTERNBLOT分別對其中的4個克隆株O05、O09、N06、N08進(jìn)行了蛋白水平的表達(dá)鑒定，結(jié)果顯示密碼子經(jīng)優(yōu)化的MHD5表達(dá)量獲得了顯著性提高。篩選出表達(dá)量最高的克隆O09進(jìn)行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過2次發(fā)酵罐發(fā)酵過程的探索，綜合采用DO值監(jiān)測、酵母細(xì)胞生長活力檢測和目的蛋白表達(dá)的檢測等措施，建立PPIC9KOMHD5GS115種子工程菌的發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，并取得不同時(shí)間段中DO值、PH值、空氣氧化傳送速率、甘油甲醇流加速率等參數(shù)的優(yōu)化值。獲得重組目的肽含量約10％的表達(dá)上清39L。6重組肽的純化與鑒定采用反相層析、親和層析、離子交換層析和分子篩層析等分離方法，建立起重組肽回收率較高的純化工藝發(fā)酵上清→NI柱親和層析→陽離子交換層析→濃縮脫鹽層析→凍干。共獲得純化重組肽1529871MG，產(chǎn)品得率為392275MGL發(fā)酵上清。產(chǎn)品經(jīng)HPLC分析，純度為8173％，經(jīng)SDSPAG、WESTERNBLOT和質(zhì)譜鑒定證實(shí)產(chǎn)品成分是重組人Α防御素5成熟肽。7生物活性檢測與作用機(jī)制探討①抗菌活性檢測應(yīng)用平板法檢測了重組肽的抗菌活性，結(jié)果表明重組產(chǎn)品對3種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、ATCC25923和ATCC27853均具有較強(qiáng)的殺滅活性。采用稀釋法測定了重組肽對14種菌株包括3種標(biāo)準(zhǔn)菌株和13種臨床分離菌株的MIC，結(jié)果顯示產(chǎn)品具有很強(qiáng)的殺滅G菌活性，對G菌的作用稍弱。②抗菌機(jī)制初探應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡觀察了ATCC25922和ATCC259232種菌株與重組肽作用前后的形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)了重組人Α防御素5成熟肽引起G菌細(xì)胞外膜脂質(zhì)突起，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊，進(jìn)而導(dǎo)致菌體腫脹、破碎的現(xiàn)象；而G菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)有明顯改變。結(jié)果顯示，人Α防御素5是通過“地毯機(jī)制”作用模型發(fā)揮的抗菌活性。③抗病毒活性檢測首先采用MTT法檢測了重組產(chǎn)品對HELA細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明在100UGML以下濃度，重組肽對細(xì)胞無毒性作用。通過基因轉(zhuǎn)染和病毒擴(kuò)增與濃縮、純化，成功制備基因組中含熒光蛋白閱讀框的重組HPV5含紅色熒光蛋白基因和HPV16含綠色熒光蛋白基因病毒液，測得后者的感染性滴度為51010。以HELA細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行重組肽抑制HPV感染的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析表明重組肽對HPV具有很強(qiáng)的抑制活性，且活性與濃度呈依賴關(guān)系，當(dāng)重組肽濃度達(dá)667UGML時(shí)，抑制率達(dá)90％以上?？共《净钚缘臅r(shí)間效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)表明，人Α防御素5抗HPV的活性發(fā)生在病毒感染細(xì)胞的早期過程，作用機(jī)制可能包括防御素作用于細(xì)胞后提高了靶細(xì)胞的抗病毒能力?？傊?，本課題完成了人Α防御素5的開發(fā)性研究，建立了從基因克隆、載體及其表達(dá)系統(tǒng)的選擇與構(gòu)建、表達(dá)種子工程菌的篩選、發(fā)酵表達(dá)條件的優(yōu)化與放大，直至產(chǎn)物的分離純化、生物活性測定等整套工藝。為大量制備具有生物活性的人Α防御素5及其它類似多肽搭建了平臺，促進(jìn)了防御素臨床前研究的進(jìn)程，并為其走向臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。