簡介：發(fā)酵濃度偏低，能耗高，原料利用率低等問題導(dǎo)致了我國酒精行業(yè)生產(chǎn)成本居高不下，嚴(yán)重制約了酒精工業(yè)的發(fā)展。選育高產(chǎn)、高效的優(yōu)良菌株可以大幅度地提高酒精的發(fā)酵產(chǎn)率，提高酒精生產(chǎn)行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。鑒于離子束注入在微生物菌種選育等方面產(chǎn)生了顯著作用，并大幅度提高了產(chǎn)物的產(chǎn)量，本論文將離子束注入技術(shù)應(yīng)用于酵母的誘變，以提高酒精發(fā)酵水平。公司現(xiàn)有的一株酒精生產(chǎn)菌FY002，是酒精生產(chǎn)水平較高、性狀穩(wěn)定的菌種，但是和國內(nèi)先進(jìn)水平相比，仍然存在較大差距。而且，F(xiàn)Y002酵母是適合于清液發(fā)酵的菌種，不適合酒精帶渣發(fā)酵或濃醪發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)酒精生產(chǎn)菌的生長特性進(jìn)行了深入研究，測定了其生長曲線，確定了酒精耐性和耐溫性。隨后，研究了低能離子注入酒精生產(chǎn)菌的誘變效應(yīng)，由此確定了最佳誘變方案經(jīng)多次離子注入，以TTC為初篩培養(yǎng)基，以己糖激酶活力和麥角甾醇含量為篩選指標(biāo)，獲得了一株酒精高產(chǎn)菌FY258，同時(shí)也為工業(yè)微生物的改良提供了一條全新的途徑。在獲得了新的高產(chǎn)菌株FY258后，對(duì)其生長特性、發(fā)酵規(guī)律進(jìn)行了研究探討，同時(shí)，以玉米糖化醪為原料，通過對(duì)糖液的供給方式、溫度、氧氣、代謝產(chǎn)物單因素實(shí)驗(yàn)，確定了最優(yōu)化發(fā)酵條件，并在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行了中試驗(yàn)證。采用FY258酵母作菌株，在玉米粉糖化醪中發(fā)酵，30℃、60H條件下，中試發(fā)酵酒精度為132％，殘?zhí)?5G100ML，產(chǎn)酒精能力比出發(fā)菌提高了110％，糖醇轉(zhuǎn)化率提高了948％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，離子束生物工程在酒精高產(chǎn)菌株選育的應(yīng)用較為成功。

簡介：本文分析了國內(nèi)外學(xué)科交叉特征的研究現(xiàn)狀，盡管目前學(xué)科交叉特征研究的方法挺多，主要有期刊共引分析、作者共引分析、共詞分析、學(xué)科共類分析、直接引文分析、作者共現(xiàn)分析，但是國內(nèi)外學(xué)者在使用這些方法研究學(xué)科交叉特征時(shí)，只是單一的使用方法，并沒有結(jié)合學(xué)科交叉特征識(shí)別的指標(biāo)，沒有形成系統(tǒng)、科學(xué)的研究體系，所以導(dǎo)致對(duì)學(xué)科交叉研究了解的不夠深入，不能全面深入的將學(xué)科交叉特征展示出來。文章在眾多學(xué)者對(duì)學(xué)科交叉研究的基礎(chǔ)之上，利用學(xué)科共類分析、期刊共引分析、共詞分析、作者共現(xiàn)分析這幾種共現(xiàn)分析方法，結(jié)合社會(huì)網(wǎng)絡(luò)分析方法的軟件比如BIBEXCEL、UCI、DRAW建立學(xué)科之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，再利用學(xué)科交叉特征識(shí)別的指標(biāo)，親緣性指標(biāo)、群體的核心邊緣結(jié)構(gòu)指標(biāo)、學(xué)科多樣性指標(biāo)、影響力指標(biāo)，對(duì)學(xué)科交叉特征進(jìn)行識(shí)別，這樣就形成了系統(tǒng)、科學(xué)的研究學(xué)科交叉特征的體系，并以生物醫(yī)學(xué)工程為例，更加詳細(xì)的說明共現(xiàn)分析在學(xué)科交叉特征識(shí)別中的應(yīng)用，驗(yàn)證了上述研究學(xué)科交叉特征的體系的實(shí)用性，在文章的最后，我們還對(duì)上述的幾種共現(xiàn)分析方法做了簡單的對(duì)比，指出了每種方法的優(yōu)勢及局限性，為優(yōu)化研究學(xué)科交叉特征的體系做了很好的參考。本文的研究成果在豐富、發(fā)展學(xué)科交叉研究的方法上具有重要的理論意義，對(duì)于客觀、全面、系統(tǒng)的研究學(xué)科交叉特征上具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

簡介：茶氨酸THEANINE不僅是茶葉中的特征氨基酸，而且是茶湯特殊風(fēng)味和鮮爽味的主要成分，是評(píng)價(jià)高級(jí)綠茶的重要標(biāo)志。同時(shí)，大量研究和臨床試驗(yàn)表明茶氨酸具有促進(jìn)大腦功能和神經(jīng)的生長、抗腫瘤、降壓安神等功效。居于以上特點(diǎn)，其制備研究在目前的茶學(xué)研究中逐漸成為一個(gè)熱點(diǎn)。由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸，成本較高；化學(xué)合成茶氨酸工藝較復(fù)雜；組織培養(yǎng)合成茶氨酸產(chǎn)量低開展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。本論文將生物技術(shù)運(yùn)用到天然產(chǎn)物制備技術(shù)中，開展了工程菌構(gòu)建方面工作。本論文通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建了工程菌，優(yōu)化了工程菌催化合成茶氨酸的條件，從而達(dá)到提高茶氨酸產(chǎn)量的目的。主要研究結(jié)果如下1、以培養(yǎng)好的ESCHERICHIACOLIDH5AECOLIDH5A菌液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增出的Γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因片斷和載體PUC19，相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PUC19GGT，將重組質(zhì)粒PUC19GGT轉(zhuǎn)化至ECOLIDH5A中，構(gòu)建工程菌。工程菌株經(jīng)01MMIPTG在32℃誘導(dǎo)后，經(jīng)酶活性檢測，工程菌株每克濕菌體的酶活達(dá)到0236UML友右，約是出發(fā)菌株ECOLIDH5A的26倍。工程菌經(jīng)32℃培養(yǎng)6H左右，然后再加IPTG至01MM于32℃誘導(dǎo)表達(dá)4H收集菌體。1ML反應(yīng)體系含035ML谷氨酰胺、20M鹽酸乙胺、70MGML菌體、PH95于30℃培養(yǎng)4H，茶氨酸的最大生成量為0475GL左右。2、以培養(yǎng)好的熒光假單胞的菌液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增出的谷氨酰胺合成酶基因片斷和載體PET32A，相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PETGS，將重組質(zhì)粒PETGS轉(zhuǎn)化至ECOLIBL21中，構(gòu)建工程菌工程菌株經(jīng)01MMIPTG在28℃誘導(dǎo)后，經(jīng)酶活性檢測，工程菌株濕菌體的酶活達(dá)到4170UMGPROT左右，約是出發(fā)菌株ECOLIBL21的1265倍。3、本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工程菌PETGS催化合成茶氨酸的反應(yīng)條件，工程菌經(jīng)32℃培養(yǎng)6H左右，然后再加IPTG至0IMM于28℃誘導(dǎo)表達(dá)4H收集菌體。1ML反應(yīng)體系L谷氨酸鈉02M，鹽酸乙胺12M，咪唑100MM，MNC15MM，ATP30MM，菌體100MGML，PH95，200RPM，于30℃培養(yǎng)14H，茶氨酸的最大生成量為62GL左右。

簡介：我國是一個(gè)能源消耗大國，石油供需嚴(yán)重不平衡，已經(jīng)成為制約我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素之一。然而，由于各種原因，采油過程中都會(huì)有石油烴類的溢出和大量含油廢水排放，造成水體和土壤嚴(yán)重的污染。因此，油田生產(chǎn)迫切需要能夠提高采油效率以及減少污染排放的清潔生產(chǎn)技術(shù)。微生物采油技術(shù)ME利用環(huán)境中微生物對(duì)原油的作用提高石油產(chǎn)量，具有消耗低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是目前廣受關(guān)注的減污降耗的油田清潔生產(chǎn)技術(shù)。而對(duì)油田環(huán)境中原本存在的“本源”微生物群落的解析和調(diào)控是研究、開發(fā)和利用該技術(shù)的關(guān)鍵。同時(shí)構(gòu)建原油高效降解菌群，也為提高采油效率和高效處理含油廢水奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。本研究采用分子生物學(xué)方法TRFLP和克隆文庫分析方法對(duì)來自某采油廠的三個(gè)區(qū)塊聯(lián)合站，注入井，油井的污水樣和油井采出液樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)區(qū)塊水樣中的細(xì)菌群落TRFLP圖譜相似性比較低，說明其群落結(jié)構(gòu)差異很大，同一個(gè)區(qū)塊不同取樣點(diǎn)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異也較大，細(xì)菌的優(yōu)勢種群也各不相同，其細(xì)菌群落主要有四個(gè)類群變形桿菌PROTEOBACTERIA，擬桿菌BACTEROIDETES，脫鐵桿菌DEFERRIBACTERES，以及未確定分類的類群而在水樣古菌群落結(jié)構(gòu)方面，不同區(qū)塊的古菌群落結(jié)構(gòu)有著明顯的差異。同一區(qū)塊古菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，來自同一地層環(huán)境的樣品相似性很高，古菌賴以生存的某種特定極端環(huán)境條件是決定其群落結(jié)構(gòu)的主要因素。通過利用TRFLP的方法對(duì)油藏中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析監(jiān)控，可以避開微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的各種缺陷，從而更客觀準(zhǔn)確的掌握油藏土著微生物的種類數(shù)量及其在群落中的分配比例，然后為以后按比例構(gòu)建混合菌劑，進(jìn)行外源投加，從根本上刺激提高采油微生物的數(shù)量和活性提供可靠的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。同時(shí)，也為以后篩選構(gòu)建高效原油降解菌群，解決石油污染生物治理問題奠定了良好的理論基礎(chǔ)。本次研究還通過電轉(zhuǎn)化的方法將含有原油降解功能基因LYS的質(zhì)粒PKSPHI12通過電擊導(dǎo)入宿主菌S25A1的感受態(tài)中，構(gòu)建出一株具有原油降解功能的基因工程菌PKS25A1。通過原油降解試驗(yàn)，對(duì)其原油降解功能進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該工程菌對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)烷烴有較強(qiáng)的降解能力，為高效處理含油廢水提供了理論和參數(shù)依據(jù)綜上所述，通過對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，準(zhǔn)確的掌握土著微生物的種類和數(shù)量，不僅為后續(xù)開發(fā)和應(yīng)用減污降耗的油田清潔生產(chǎn)技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)，也為篩選構(gòu)建高效原油降解菌群，調(diào)控油田廢水處理中微生物群落結(jié)構(gòu)以及開發(fā)高效廢水處理工藝提供了理論依據(jù)。而構(gòu)建原油降解基因工程菌的研究，則為原油中重質(zhì)成份的降解，改善原油流動(dòng)性，提高采油率；進(jìn)一步提高含油廢水處理效率提供了可靠的技術(shù)支持。

簡介：分類號(hào)R7722密級(jí)⑧V▲單位代碼學(xué)號(hào)東『，蚤10422200713047博士學(xué)位論文論文題目脫細(xì)胞角膜基質(zhì)聯(lián)合內(nèi)皮樣細(xì)胞構(gòu)建生物工程角膜后板層的實(shí)驗(yàn)研究CONSTRUCTIONOFBIOENGINEEREDCORNEALPOSTERIORLAMENAWITHACELLULARCORNEALMATRIXANDENDOTHELIALCELL1IKECELLS作者姓名鞫成狴學(xué)院名稱醫(yī)堂院專業(yè)名稱醌科堂指導(dǎo)教師昱放憧教授合作導(dǎo)師2012年4月10日原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名麴瘟曼聾日期蓋6關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全R解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位淪文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定論文作者簽名麴區(qū)整導(dǎo)師簽名墨趔塹I_1期B126

簡介：本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)氣體壓縮的原理，自行設(shè)計(jì)了能夠按一定頻率、幅度和時(shí)程對(duì)細(xì)胞材料復(fù)合物施加周期性軸向牽拉刺激的生物反應(yīng)器。在以上工作的基礎(chǔ)上，我們利用雞肌腱細(xì)胞和PGA支架在反應(yīng)器中構(gòu)建肌腱，比較周期性張力和無張力狀態(tài)對(duì)體外構(gòu)建的影響。本文分三部分第一部分聚羥基乙酸編織線在肌腱組織工程中的適用研究第二部分反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與優(yōu)化第三部分利用生物反應(yīng)器構(gòu)建肌腱結(jié)論1、采用荷蘭普拉克公司原料開發(fā)的PGA編織材料具有良好的生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度，是肌腱構(gòu)建的良好選擇。2、力學(xué)環(huán)境對(duì)構(gòu)建肌腱有重要影響。利用我們自行開發(fā)的反應(yīng)器可以構(gòu)建出結(jié)構(gòu)、功能更佳的肌腱組織。3、組織生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種因素影響。采用目前的培養(yǎng)體系，體外培養(yǎng)時(shí)間過長，可能不利于肌腱構(gòu)建。綜上可見，本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為相關(guān)生物力學(xué)研究提供了理論依據(jù)。

簡介：網(wǎng)化生物陶瓷支架由于良好的三維貫通結(jié)構(gòu)和骨傳導(dǎo)性，可以作為細(xì)胞粘附、遷移、分化和增殖的三維模板，有利于血管化的形成并引導(dǎo)組織的生長，在組織工程支架領(lǐng)域已經(jīng)得到非常廣泛的應(yīng)用。但是由于陶瓷的脆性，其力學(xué)性能一直無法滿足體內(nèi)承力部位植入的需要，大大限制了它的臨床應(yīng)用。因此，改善網(wǎng)化生物陶瓷支架的力學(xué)性能就變得尤為重要。本文主要采用有機(jī)泡沫浸漬法制備網(wǎng)化羥基磷灰石HA陶瓷支架，通過比較初始粉體的形狀優(yōu)化制備工藝，然后對(duì)網(wǎng)化支架進(jìn)行力學(xué)和生物學(xué)性能的優(yōu)化。分別采用熱等靜壓和聚合物浸涂法改善支架力學(xué)性能；同時(shí)，為了改善網(wǎng)化支架的生物學(xué)性能，利用仿生礦化技術(shù)，對(duì)網(wǎng)化TI金屬支架、HAPCL和HAPDLLA支架進(jìn)行了表面生物活化，以改善支架對(duì)細(xì)胞等的親和性。此外，采用擠壓法成功改善了顆粒造孔制備的多孔HA陶瓷支架的貫通性，達(dá)到了多孔結(jié)構(gòu)網(wǎng)化目的，同時(shí)具有更高的力學(xué)性能，并系統(tǒng)考察了造孔顆粒大小等因素對(duì)支架力學(xué)性能的影響。采用粘度計(jì)、體視顯微鏡、掃描電子顯微鏡SEM、X射線衍射儀XRD、和抗壓強(qiáng)度測試等分析手段，系統(tǒng)地研究了網(wǎng)化HA支架的性能。獲得的主要結(jié)論如下1采用有機(jī)泡沫浸漬法成功地制備了網(wǎng)化羥基磷灰石HA陶瓷支架，研究了不同顆粒形態(tài)的HA粉體對(duì)網(wǎng)化HA陶瓷支架力學(xué)強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明球形HA粉體所制備的網(wǎng)化陶瓷具有最佳的燒結(jié)性能和力學(xué)性能，這是由于球形HA粉體顆粒間具有最佳的堆積效果，所配制的漿料具有最高的粘度，因此在樣品的浸漬涂覆過程中，泡沫上涂覆的HA漿料最多，因此最終燒結(jié)的網(wǎng)化支架的骨架最厚。2采用了熱等靜壓、PCL涂層涂覆和PDLLA涂層涂覆等方法改善網(wǎng)化HA陶瓷支架的力學(xué)性能，研究了不同方法改善支架力學(xué)性能的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1三種方法均能有效地改善網(wǎng)化HA陶瓷支架的力學(xué)性能，采用聚合物涂覆法對(duì)支架的力學(xué)性能改善更明顯；2熱等靜壓法對(duì)支架力學(xué)性能的改善是因?yàn)樵诙螣Y(jié)過程中，晶粒進(jìn)一步致密化，使支架內(nèi)部的微孔和微裂紋明顯減少；3網(wǎng)化HA陶瓷支架涂覆聚己內(nèi)酯PCL和聚乳酸PDLLA涂層，不僅在表面能觀察到聚合物，在網(wǎng)化多孔結(jié)構(gòu)骨架微孔內(nèi)部也有一些滲透的聚合物，從而實(shí)現(xiàn)了聚合物與陶瓷骨架的復(fù)合，在一定程度上降低支架的脆性，達(dá)到補(bǔ)強(qiáng)增韌的效果；3利用仿生礦化技術(shù)對(duì)網(wǎng)化支架的多孔結(jié)構(gòu)上進(jìn)行CAP涂層修飾，改善其生物學(xué)性能1通過在模擬體液SBF中仿生礦化，成功地在多孔TI支架多孔結(jié)構(gòu)表面沉積具有納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的CAP涂層，支架的三維貫通結(jié)構(gòu)不變；2通過在過飽和的鈣磷溶液SCPS中仿生礦化，成功在HAPCL復(fù)合支架表面修飾具有片層狀結(jié)構(gòu)的CAP涂層；3在PDLLA涂層中添加CASO4和硫酸軟骨素CS顆粒可以成功地改善復(fù)合支架的生物活性，在SBF中仿生礦化7天和14天后支架表面出現(xiàn)納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的CAP涂層，添加CASO4的復(fù)合支架的生物活性更好；SBF的濃度會(huì)影響仿生礦化CAP涂層的微觀結(jié)構(gòu)，在1倍SBF中CAP涂層呈納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在15倍SBF中呈片層狀結(jié)構(gòu)。4采用擠壓法成功地改善顆粒造孔工藝制備的多孔HA陶瓷支架的貫通性，實(shí)現(xiàn)了完全網(wǎng)化的多孔貫通結(jié)構(gòu)；造孔劑的顆粒大小基本不影響支架的孔隙率；支架的收縮率與造孔劑蠟球大小和成形劑甲殼素?zé)o關(guān)；影響支架收縮率的主要因素是HA的濃度，HA的濃度越高，支架的收縮率越小，但過高的HA濃度不利于支架的收縮；造孔劑粒度對(duì)支架的抗壓強(qiáng)度有明顯影響隨著蠟球粒度的增大，對(duì)應(yīng)的網(wǎng)化HA陶瓷支架的抗壓強(qiáng)度逐漸降低。

簡介：成熟的心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，缺乏再生能力。因此，心肌損傷后導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆的丟失，只能由成纖維細(xì)胞增生形成瘢痕而修復(fù)。設(shè)法增加心臟內(nèi)心肌細(xì)胞或心肌樣細(xì)胞的數(shù)量能改善此類患者的心功能。組織工程學(xué)的誕生為人類再造各種有功能的人體組織或器官帶來了希望，同時(shí)也為病損的心肌提供了修復(fù)的可能性。組織工程學(xué)是將細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)、工程學(xué)相結(jié)合進(jìn)行體外構(gòu)建組織或器官的新興學(xué)科。其基本原理是將體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的，具有特定生物學(xué)功能的種子細(xì)胞與可降解材料相結(jié)合，形成細(xì)胞一材料復(fù)合物，在體外培養(yǎng)一定時(shí)間后植入體內(nèi)用以修復(fù)替代病損的組織器官。近年來，國內(nèi)外心肌組織工程研究取得了明顯進(jìn)展，展現(xiàn)了良好的臨床應(yīng)用前景。當(dāng)今可供臨床應(yīng)用的修復(fù)材料都缺乏導(dǎo)電性，并有鈣化和血栓生成的危險(xiǎn)。目前導(dǎo)電高分子材料已悄然走進(jìn)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是生物材料和組織工程學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。聚吡咯等高分子聚合物可以像金屬一樣導(dǎo)電而且可以制作成各種特殊性能的新材料，但缺乏導(dǎo)電性限制了其在心肌組織工程中的應(yīng)用。目前已經(jīng)有人針對(duì)聚苯胺等電活性聚合物存在的生物相容性差、不可降解以及溶解性差難以加工等等缺陷進(jìn)行了相關(guān)的改性研究工作，制備出了可生物降解的脂肪族聚酯與苯胺低聚體的嵌段共聚物。通過將脂肪族聚酯和天然生物高分子的引入，不僅可以大大提高電活性材料的溶解性，使其可以在如氯仿，四氫呋喃和水等低沸點(diǎn)溶劑中具有較高的溶解度，同時(shí)還極大地提高了材料的生物相容性。而引入的苯胺低聚體，它不僅具有和聚苯胺相似的電活性，同時(shí)由于其短的共軛結(jié)構(gòu)，當(dāng)材料中可生物降解的部分消失之后，苯胺低聚體可以通過腎臟排出體外，真正達(dá)到達(dá)了可吸收生物材料的體內(nèi)應(yīng)用要求。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究聚乳酸與苯胺五聚體的嵌段共聚物在心肌組織工程中的應(yīng)用。方法利用C6和H9C2細(xì)胞系，MTT法及熒光染色法研究材料的細(xì)胞毒性，細(xì)胞粘附性；并且在特定的電壓及5V，1HZ，500MS頻率的存在下，研究一段時(shí)間內(nèi)，材料的電活性對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及增殖的影響。同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度進(jìn)行了檢測。結(jié)果結(jié)果表明，嵌段共聚物的細(xì)胞毒性小僅次于聚乳酸，細(xì)胞粘附性最好，在特定的電壓及5V，1HZ，500MS頻率的存在下，材料的電活性促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，同時(shí)，在形態(tài)上，出現(xiàn)了類似神經(jīng)“突觸”樣的結(jié)構(gòu)。并且，電刺激后，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度有所增加。

簡介：該研究通過對(duì)025﹪胰酶不同脫細(xì)胞時(shí)間處理、不同濃度胰酶處理、DISPASE脫細(xì)胞法、1M、2M高滲鹽水脫細(xì)胞法、高滲鹽水和胰酶工DISPASE混合脫細(xì)胞法的比較確認(rèn)采用0125﹪胰酶4℃24小時(shí)可脫盡豬真皮內(nèi)細(xì)胞胰酶脫細(xì)胞法和DISPASE脫細(xì)胞法在病理切片上無顯著性差異而單純的高滲鹽水脫細(xì)胞方法的可行性值得商榷至于高滲鹽水和胰酶或DISPASE混合脫細(xì)胞法它與單純的胰酶或DISPASE脫細(xì)胞法無顯著性差異實(shí)驗(yàn)對(duì)脫細(xì)胞后基質(zhì)中細(xì)胞碎片的清除進(jìn)行了比較研究選用了05﹪TRITONX100和05﹪SDS對(duì)比研究后發(fā)現(xiàn)用05﹪TRITONX100及其與05﹪SDS的1125、11、1075、105、1025、10125混合液洗滌按該實(shí)驗(yàn)方法效果不佳而05﹪SDS振蕩洗滌3小時(shí)可較好地清除細(xì)胞碎片但是經(jīng)這樣洗滌清除細(xì)胞碎片后基質(zhì)的物理性能與洗滌前相比顯著降低研究中發(fā)現(xiàn)真皮基質(zhì)經(jīng)脫細(xì)胞后其膠原結(jié)構(gòu)崩解為防止膠原結(jié)構(gòu)崩解對(duì)基質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞前用戊二醛固定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4﹪戊二醛對(duì)基質(zhì)交聯(lián)固定后若交聯(lián)時(shí)間短則與不交聯(lián)組無差異時(shí)間稍長則胰酶無法脫除細(xì)胸為了提高脫細(xì)胞后基質(zhì)的強(qiáng)度和調(diào)控基質(zhì)體內(nèi)降解速率實(shí)驗(yàn)選擇了戊二醛對(duì)脫細(xì)胞生物基質(zhì)交聯(lián)固定結(jié)果顯示戊二醛可以大大提高經(jīng)SDS洗滌后脫細(xì)胞基質(zhì)的物理性能Α半乳糖殘基是豬到人的主要異種抗原會(huì)導(dǎo)致超急性免疫排斥要實(shí)現(xiàn)豬到人的異種移植首先要去除的就是ΑGAL所以實(shí)驗(yàn)對(duì)制備的基質(zhì)進(jìn)行了ΑGAL的定性測試免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)胰酶和DISPASE處理后及SDS洗滌后的脫細(xì)胞基質(zhì)均無ΑGAL活性實(shí)驗(yàn)測定了脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞毒性結(jié)果表明經(jīng)SDS洗滌及戊二醛交聯(lián)固定后的基質(zhì)應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格清洗否則會(huì)表現(xiàn)細(xì)胞毒性這主要是因?yàn)镾DS洗滌后會(huì)殘留于基質(zhì)中而且洗脫比較困難但是只要徹底清洗采用該實(shí)驗(yàn)方法仍可做到基質(zhì)細(xì)胞毒性通過對(duì)基質(zhì)進(jìn)行鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、種植上的細(xì)胞形態(tài)學(xué)掃描電鏡觀察及在兔觀肉和皮下組織相容性觀察可以初步認(rèn)定這樣制備的脫細(xì)胞生物基質(zhì)具有良好的生物相容性

簡介：本文主要從以下四個(gè)部分展開論述第一部分人類胰島素樣生長因子1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建目的構(gòu)建表達(dá)人類胰島素樣生長因子HIGF1基因的病毒載體及表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的對(duì)照載體為實(shí)現(xiàn)IGF1基因在大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞中的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。方法將目的基因HIGF1CDNA亞克隆到載體PLGXSN載體上構(gòu)建重組載體PLGHIGF1SN同法將目的基因EGFP亞克隆到載體PLGXSN載體上構(gòu)建重組載體PLGEGFPSN并通過酶切DNA測序鑒定構(gòu)建載體是否正確。結(jié)果經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序分析表明插入到載體中的IGF1CDNA及EGFP的基因片段和GENBACK公布的序列相符。結(jié)論表達(dá)人類胰島素樣生長因子及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組載體PLGHIGF1SN、PLGEGFPSN構(gòu)建成功。第二部分人類胰島素樣生長因子1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝及病毒的制備目的通過乒乓轉(zhuǎn)導(dǎo)法對(duì)病毒載體進(jìn)行包裝為介導(dǎo)人類胰島素樣生長因子HIGF1在成肌細(xì)胞中的表達(dá)獲取高滴度的病毒上清。方法脂質(zhì)體2000為介導(dǎo)GPE86和PT67兩種包裝細(xì)胞相互乒乓感染的方法包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLGHIGF1SNPLGEGFPSN作為對(duì)照監(jiān)測包裝效果包裝成功后通過G418持續(xù)篩選2周產(chǎn)生穩(wěn)定的病毒生產(chǎn)細(xì)胞線。NIH3T3細(xì)胞法測定病毒滴度從中選取高滴度的病毒克隆凍存。結(jié)果1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后熒光即時(shí)表達(dá)效率達(dá)30％左右2乒乓感染PT6724小時(shí)后可見熒光蛋白表達(dá)持續(xù)G418篩選2周后陽性細(xì)胞克隆全部表達(dá)綠色熒光。3PLGHIGF1SN組病毒滴度最高可達(dá)5106CFUML滴度明顯高于單純E86包裝法。結(jié)論乒乓感染法可成功對(duì)PLGHIGF1SN進(jìn)行包裝并能獲取高滴度的病毒上清。第三部分人類胰島素樣生長因子1在大鼠成肌細(xì)胞中的表達(dá)及活性觀察目的建立大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的大批量培養(yǎng)方法為試驗(yàn)提供足夠的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)HIGF1在成肌細(xì)胞中的表達(dá)并觀察其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。方法1分別采用消化法及組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng)DESMIN和ACTIN抗體對(duì)成肌細(xì)胞的純度進(jìn)行測定并觀察其生長曲線及凍存復(fù)蘇之后的生長規(guī)律。2HIGF1病毒上清感染成肌細(xì)胞G418篩選2周獲得抗性成肌細(xì)胞ELISA檢測上清中HIGF1的表達(dá)。3內(nèi)皮細(xì)胞分組后分別給予OXLDL及成肌細(xì)胞上清干預(yù)MTT法檢測細(xì)胞活力DAPI細(xì)胞核熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)及細(xì)胞凋亡率WESTERN檢測細(xì)胞內(nèi)CASPASE3及BCL2的表達(dá)以驗(yàn)證成肌細(xì)胞分泌的HIGF1的生物活性。結(jié)果1原代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞經(jīng)45分鐘差速之后DESMIN和ACTINE抗體鑒定顯示純度可達(dá)80以上。經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)可分化為肌管成肌細(xì)胞在培養(yǎng)4天左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期凍存之后復(fù)蘇的成肌細(xì)胞存活率達(dá)50短期之內(nèi)能快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期2經(jīng)過G418篩選2周后成肌細(xì)胞表達(dá)HIGF1的濃度在30NGML左右總量可以達(dá)到150200NG2106D。未轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞組人類胰島素樣生長因子I總量在018士0092106D。3OXLDL可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞活力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡加入成肌細(xì)胞分泌的HIGF1后細(xì)胞凋亡率由173±121下降至62±075P結(jié)論消化法和組織塊法均可在短期之內(nèi)獲得大量的成肌細(xì)胞成肌細(xì)胞的純度達(dá)到90大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞可成功表達(dá)外源性蛋白質(zhì)HIGF1并具有生物活性。第四部分人類胰島素樣生長因子1修飾的人工肌肉的制備及蛋白質(zhì)表達(dá)目的構(gòu)建人類胰島素樣生長因子1修飾的組織工程生物人工肌肉并使其表達(dá)外源性人類胰島素樣生長因子1。方法1采用特殊的模型及試劑使轉(zhuǎn)染成功的成肌細(xì)胞在模型內(nèi)生長成三維的組織工程生物人工肌肉。2ELISA法檢測人工肌肉分泌的外源類胰島素樣生長因子1的表達(dá)。結(jié)果1成肌細(xì)胞在特殊的模型和試劑中4天左右可以組織工程為生物人工肌肉。2人工肌肉表達(dá)HIGF1的總量可達(dá)150300NG2106D。結(jié)論組織工程生物人工肌肉構(gòu)建成功經(jīng)基因修飾組織工程生物人工肌肉可表達(dá)外源性蛋白質(zhì)HIGF1。

簡介：目的以綠色熒光蛋白GFP基因?yàn)閳?bào)告基因，和重金屬鎘特異性啟動(dòng)子PCADA構(gòu)建成基因工程重組體導(dǎo)入宿主菌，用于重金屬鎘的特異性檢測。方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR從質(zhì)粒PPCADA上擴(kuò)增得到重金屬鎘離子特異性啟動(dòng)子PCADA，以綠色熒光蛋白基因?yàn)閳?bào)告基因，以大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體PNGFP構(gòu)建了綠色熒光蛋白鎘離子誘導(dǎo)表達(dá)載體。以枯草芽孢桿菌1A751為宿主菌，采用感受態(tài)轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體導(dǎo)入1A751，成功構(gòu)建鎘離子檢測工程菌株。分別采用不同種類的金屬離子對(duì)工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，通過測定熒光強(qiáng)度考察工程菌株對(duì)鎘離子的特異性。將工程菌株暴露于不同濃度的二價(jià)鎘離子CD2環(huán)境中，在一定的時(shí)間內(nèi)測定熒光強(qiáng)度的大小，考察工程菌株對(duì)鎘離子的敏感性，了解工程菌株對(duì)CD2的敏感濃度范圍及響應(yīng)時(shí)間并考察工程菌株用于快速檢測重金屬鎘的可行性。結(jié)果從工程菌株中提取的重組質(zhì)粒PPCADAGFP通過酶切鑒定、PCR鑒定顯示啟動(dòng)子已成功插入載體DNA中，DNA序列分析與預(yù)期結(jié)果完全一致，說明重組體PPCADAGFP構(gòu)建成功。工程菌株對(duì)鎘以外的11種重金屬離子AS3、CO2、CU2、FE2、HG2、MN2、NI2、PB2、SB3、SN2、ZN2基本沒有響應(yīng)，僅對(duì)CD2產(chǎn)生明顯的效應(yīng)，說明工程菌株對(duì)鎘離子具備較好的特異性。使用不同濃度的鎘在誘導(dǎo)不同時(shí)間后觀察GFP的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)工程菌株對(duì)CD2的敏感性較好，檢測范圍為1ΜM500ΜM，在1ΜM250ΜM之間時(shí)熒光強(qiáng)度與鎘離子的濃度呈正相關(guān)。檢測下限為1ΜM，響應(yīng)時(shí)間為15MIN在暴露于重金屬鎘后15MIN10HR范圍內(nèi)，工程菌株對(duì)敏感濃度內(nèi)的CD2均有很好的響應(yīng)。結(jié)論實(shí)驗(yàn)表明，該工程菌株能夠以綠色熒光蛋白基因?yàn)閳?bào)告基因檢測培養(yǎng)體系中最低濃度達(dá)1ΜM的鎘離子；利用該菌株有望建立起一種方便快捷的重金屬鎘的檢測方法，有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文抗KDR基因工程抗體的研制及生物學(xué)活性研究姓名李容申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)分子藥理學(xué)指導(dǎo)教師楊純正朱禎平20040501中∞匱攀科學(xué)M中L協(xié)P醫(yī)科太掌博女目RT畢MI達(dá)量可達(dá)2MG／L培養(yǎng)基。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)抗ETAG親和層析純化，獲得純度在90％以上的KDR胞外III區(qū)融合蛋白。進(jìn)一步使用純化可溶性KDR胞外III區(qū)融合蛋白作為抗原免疫小鼠，采用細(xì)胞融合技術(shù)制各單克隆抗體。經(jīng)過多輪交叉篩選，我們最終獲得了一株能穩(wěn)定分泌抗KDR胞外III區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株YAOMLD3。體外生物活性研究表明，該單克隆抗體不僅可與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原及細(xì)胞表面表達(dá)的KDR結(jié)合，還可競爭性抑制VEGF。與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原的結(jié)合，阻斷VEGF。刺激內(nèi)皮細(xì)胞表面KDR酪氨酸激酶受體磷酸化，并可顯著抑制VEGF。；誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體外三維膠原模型上內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成，具有潛在的抗腫瘤血管新生臨床應(yīng)用價(jià)值。為克服鼠源性單抗自身固有的一些缺陷，我們對(duì)其進(jìn)行了基因工程抗體的改造。通過采用通用簡并性引物，成功克隆了抗KDR單克隆抗體YAOMLD3輕、重鏈可變區(qū)基因，并采用GLY。SER。柔性連接短肽將重、輕鏈可變區(qū)基因前后連接為單鏈抗體片段，在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，經(jīng)變性、純化、透析復(fù)性，最終得到能特異性與KDR表達(dá)陽性的HUVEC細(xì)胞結(jié)合的活性產(chǎn)物。ELISA及免疫熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明該單鏈抗體保留了親本單克隆抗體的特異性結(jié)合活性，并可競爭性抑制VEGF。與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原的結(jié)合，無論是作為靶向診斷治療的載體還是作為雙功能抗體的一臂，均具有廣泛的應(yīng)用前景。HIT3A是我所研制的鼠源性抗CD3單克隆抗體，并已經(jīng)過國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組的正式命名。在成功構(gòu)建、表達(dá)抗KDR單鏈抗體的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步克隆了抗CD3單抗HIT3A和抗KDR單抗YCOMLD3輕、重鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建抗KDR／抗CB3DIABODY微型雙功能抗體，并在大腸桿菌中進(jìn)行了初步表達(dá)，為進(jìn)一步生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞腫瘤；血管內(nèi)皮；血管內(nèi)皮生長因子受體；單克隆抗體；單鏈抗體微型雙功能抗體2

簡介：本研究采用冷凍干燥、納米合成及仿生礦化技術(shù)，以生物活性玻璃BG、膠原蛋白COL、透明質(zhì)酸HYA、磷酸絲氨酸PS為主要成分，仿生制備生物活性骨組織工程支架，并對(duì)其理化性能、礦化特點(diǎn)、與細(xì)胞的相互作用及體內(nèi)的骨修復(fù)性能等進(jìn)行系統(tǒng)研究，具體闡述如下1膠原在體外過飽和鈣化液中的仿生礦化實(shí)驗(yàn)表明，膠原調(diào)控礦化生成的礦物相為片狀、低結(jié)晶度的碳酸羥基磷灰石。碳酸羥基磷灰石晶體在膠原的反應(yīng)成核位點(diǎn)通過化學(xué)鍵合作用進(jìn)行自組裝，這種自組裝結(jié)構(gòu)受膠原大分子與羥基磷灰石晶體之間的相互反應(yīng)以及膠原分子的微組裝能力誘導(dǎo)。2膠原的交聯(lián)研究表明，交聯(lián)可有效改善膠原作為組織工程材料的生物學(xué)和物理性能。當(dāng)1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺濃度為2MGML時(shí)，膠原具有最大交聯(lián)程度，其結(jié)構(gòu)更加緊密有序，熱穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及抵抗降解能力顯著增強(qiáng)。3以1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺N羥基琥珀酰亞胺為交聯(lián)劑，采用冷凍干燥和納米合成技術(shù)制備出高孔隙率、高濕態(tài)力學(xué)性能及形態(tài)穩(wěn)定性的仿生型BGCOLHYAPS生物活性骨組織工程支架。在模擬生理溶液中的體外生物礦化研究表明，膠原蛋白、透明質(zhì)酸、磷酸絲氨酸生物分子可在調(diào)控礦化方面起到重要作用。生物分子中的羧基和磷酸根基團(tuán)是促進(jìn)和調(diào)控礦化的有利基團(tuán)，它們對(duì)溶液中鈣、磷離子的親和力構(gòu)成了礦化機(jī)制的基礎(chǔ)，并調(diào)控著礦物的成核、定向、尺寸以及生長速率。膠原不能完成基質(zhì)礦化的全部功能，磷酸絲氨酸和透明質(zhì)酸是膠原內(nèi)礦物沉積的重要引發(fā)劑。4細(xì)胞生物活性骨組織工程支架的相互作用研究表明，BGCOLPSHYA生物活性骨組織工程支架容易被細(xì)胞識(shí)別并接受為“自體”細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞在材料的調(diào)控作用下發(fā)生黏附、生長、遷移并按自身規(guī)律完成周期演變。在培養(yǎng)過程中，BGCOLPSHYA生物活性骨組織工程支架可以起到類似細(xì)胞外基質(zhì)的模板調(diào)控作用生成碳酸羥基磷灰石類骨礦物；體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，BGCOLPSHYA生物活性骨組織工程支架植入體內(nèi)3個(gè)月后可在缺損處形成具有完整哈佛氏系統(tǒng)的新生板層骨組織，展現(xiàn)優(yōu)良的骨修復(fù)功能和臨床應(yīng)用前景。

簡介：目的各種原因如腫瘤、外傷、戰(zhàn)傷等造成的氣管缺損在臨床上較為常見，當(dāng)缺損較大，難以直接吻合修復(fù)時(shí)，氣管代替物就成為重建氣管的理想手段，目前組織工程化氣管因其在免疫排斥、材料來源等方面的優(yōu)勢逐漸為人重視。同時(shí)移植后的氣管塌陷問題也一直在困擾著人們，氣管的塌陷除了免疫、血運(yùn)等方面的因素外，去抗原的處理過程會(huì)不會(huì)對(duì)其力學(xué)支撐性能有影響呢本實(shí)驗(yàn)的目的在于檢測不同方法去抗原處理后的脫細(xì)胞氣管基質(zhì)的張開角和殘余應(yīng)變，來推斷其是否存在力學(xué)性能的改變。為氣管的組織工程化研究提供力學(xué)方面參考。方法本實(shí)驗(yàn)取用犬甲狀軟骨下第510氣管環(huán)，共分為三組A組為深低溫冷凍組，B組為新鮮氣管組，C組為改良COURTMAN法氣管黏膜脫細(xì)胞組。冷凍氣管組氣管經(jīng)程序降溫后，先放入196℃的液氮中冷凍保存6周，再復(fù)溫后檢測改良的COURTMAN方法氣管黏膜脫細(xì)胞處理移植組先經(jīng)非離子型表面活性劑TRITONX100、酶制劑聯(lián)合處理黏膜脫細(xì)胞后再檢測。新鮮組取材后于4℃DHANKS內(nèi)保存，并盡快檢測。檢測指標(biāo)及方法選取直徑及形態(tài)相近的氣管段，著色筆分別標(biāo)明氣管軟骨部分和肌肉部分的中點(diǎn)，垂直于氣管縱軸方向，將相鄰軟骨環(huán)之問的韌帶剪斷，使之成為無載荷狀態(tài)的獨(dú)立氣管環(huán)，按順序盛放在裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放在掃描儀上直接掃描，從而將無載荷狀態(tài)氣管環(huán)的幾何信息數(shù)字化存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。取得信息后，將氣管環(huán)自掃描儀上取下，從氣管環(huán)肌肉部分中點(diǎn)剪開，從而得到零應(yīng)力狀態(tài)下氣管扇形體，將其放回培養(yǎng)皿中，靜置20分鐘，待其形態(tài)穩(wěn)定后，再放回掃描儀進(jìn)行掃描，從而取得零應(yīng)力狀態(tài)下氣管環(huán)的數(shù)字幾何信息。最后，運(yùn)用專用圖像分析軟件處理掃描所得圖像，測得無載荷狀態(tài)氣管環(huán)和零應(yīng)力狀態(tài)氣管扇形體的內(nèi)、外壁弧長以及張開角等幾何尺寸。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果1新鮮氣管組B組張開角為101379±12290度，大于采用深低溫冷凍法脫細(xì)胞組A組的張開角42879±12295度P005。即新鮮組氣管外壁殘余應(yīng)變大于另外兩組脫細(xì)胞氣管基質(zhì)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩種不同方法脫細(xì)胞氣管基質(zhì)的外壁殘余應(yīng)并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。結(jié)論改良COURTMAN氣管脫細(xì)胞法構(gòu)建的組織工程氣管基質(zhì)張開角明顯大于冷凍法處理后的氣管基質(zhì)張開角，這說明采用改良COURTMAN氣管脫細(xì)胞法構(gòu)建組織工程氣管過程中，氣管力學(xué)性能變化較小，即改良COURTMAN氣管脫細(xì)胞法構(gòu)建的組織工程氣管基質(zhì)抗壓縮能力優(yōu)于冷凍法處理組的氣管基質(zhì)。

簡介：植物次生代謝產(chǎn)物是植物為了抵御外界刺激如微生物入侵與昆蟲、食草動(dòng)物傷害等脅迫而產(chǎn)生的化合物，如抗生素、生物堿、毒素等。許多次生代謝產(chǎn)物具有很好的藥理活性，是中藥和天然植物藥的主要有效成分。在外界生物或非生物的壓力脅迫下，一些植物激素，如脫落酸、水楊酸、乙烯以及茉莉酸甲酯MEJA等在植物中大量積累，通過相互作用，調(diào)控植物的信號(hào)傳遞、脅迫耐受以及次生代謝等過程，形成植物的應(yīng)激系統(tǒng)。其中，茉莉酸甲酯在植物應(yīng)激反應(yīng)和次生代謝調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。目前，MEJA作為外源誘導(dǎo)子促進(jìn)植物次生代謝物的過量積累，已得到廣泛應(yīng)用。本研究探索一種新的代謝工程策略，通過過量表達(dá)植物MEJA合成途徑上的關(guān)鍵酶基因，提高內(nèi)源MEJA的含量，進(jìn)而刺激多種次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。為了使這種新策略應(yīng)用于多種植物，節(jié)省大量克隆內(nèi)源基因的工作。本研究同時(shí)將內(nèi)源和異源基因在植物中過量表達(dá)，考察是否達(dá)到同樣的效果。在植物的茉莉酸甲酯生物合成途徑中，丙二烯氧化物環(huán)化酶ALLENEOXIDECYCALSEAOC和茉莉酸羧甲基轉(zhuǎn)運(yùn)酶JAMONICACIDCARBOXYLMETHYLTRANSFERASEJMT是重要的關(guān)鍵酶。本研究采用RACE方法，從丹參中克隆了AOC基因SMAOC，GENBANK登錄號(hào)HM156740，其CDNA全長為910BP，開放閱讀框F區(qū)編碼的蛋白質(zhì)共有245個(gè)氨基酸。該基因與其他物種中的AOC基因具有較高的同源性，與水稻OSAOC的相似度為75％，與玉米ZMAOC的相似度為74％。器官組成型分析，SMAOC在丹參中根莖葉均有分布，葉中表達(dá)量最高。SOUTHERN雜交結(jié)果顯示SMAOC在丹參中是一個(gè)低拷貝基因；RTQPCR分析顯示AOC基因表達(dá)可被多種不同的誘導(dǎo)因素，如茉莉酸甲酯、紫外線照射、低溫脅迫所誘導(dǎo)，而提高表達(dá)水平。原核表達(dá)SMAOC，SDSPAGE電泳檢測得到了預(yù)期表達(dá)的目的蛋白。耐鹽脅迫試驗(yàn)表明，表達(dá)SMAOC蛋白的細(xì)菌比對(duì)照更耐受高鹽環(huán)境。丹參中兩大類活性成分主要是以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性二萜醌類化合物和以丹參酚酸B為代表的水溶性化合物。在根癌農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)的丹參發(fā)根中分別過量表達(dá)MEJA合成途徑中的關(guān)鍵酶內(nèi)源的丹參SMAOC，異源的莨菪HNAOC和擬南芥ATJMT，結(jié)果顯示在各轉(zhuǎn)基因事件中，上述兩類化合物的含量基本上均比對(duì)照有不同程度提高。在所有轉(zhuǎn)基因株系中。轉(zhuǎn)SMAOC組的S7株系丹參酮ⅡA提高最多，達(dá)到野生發(fā)根的166倍，干重含量從0037MGG提高到056MGG；轉(zhuǎn)ATJMT組的J5株系隱丹參酮提高最多，達(dá)到野生發(fā)根的168倍，干重含量從0027MGG提高到046MGG；轉(zhuǎn)HNAOC組的H11株系迷迭香酸提高最多，達(dá)到野生型對(duì)照的219倍，干重含量從132MGG提高到289MGG；轉(zhuǎn)SMAOC組的S1株系丹參酚酸B最多比野生型對(duì)照發(fā)根提高了78％，干重含量從1073MGG提高到1907MGG。轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根中其他活性物質(zhì)丹參酮Ⅰ和二氫丹參酮以及迷迭香酸合成途徑的中間體的含量也有不同程度的提高。同時(shí)RTQPCR技術(shù)檢測了MEJA、迷迭香酸及萜類合成途徑上基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因發(fā)根中的這些合成途徑上的相關(guān)基因均有相應(yīng)地上調(diào)。本研究從多種轉(zhuǎn)基因事件證明了，MEJA生物合成途徑的基因操作可以同時(shí)對(duì)多個(gè)酶促反應(yīng)或者多條代謝途徑進(jìn)行全局調(diào)控，從而提高植物體內(nèi)多種次生代謝產(chǎn)物的含量，并且過量表達(dá)異源和內(nèi)源基因能夠產(chǎn)生同樣的效果。通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得的次生代謝產(chǎn)物含量的提高是穩(wěn)定且持久的，體現(xiàn)出比外源誘導(dǎo)更可靠更穩(wěn)定可遺傳的優(yōu)越性，為生產(chǎn)受MEJA誘導(dǎo)的次生代謝產(chǎn)物提供了一個(gè)有效的基因工程新策略。