簡介：【目的】ΒTCP是一種較理想的骨組織工程無機支架材料傳統(tǒng)的ΒTCP生物陶瓷制作方法制作的生物陶瓷其微結(jié)構(gòu)難以控制應(yīng)用于軟骨組織工程的較少。近年來法國地中海大學成功地研制了微孔結(jié)構(gòu)可控的Β磷酸三鈣多孔陶瓷材料該材料不僅具有良好的生物相容性和較高的機械強度而且可調(diào)控微結(jié)構(gòu)以適合軟骨組織工程構(gòu)建的需要。我們和上海貝奧路公司合作通過研究不同微結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架復合軟骨細胞體外培養(yǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)適合軟骨組織工程構(gòu)建的生物陶瓷支架材料微結(jié)構(gòu)。通過對兔解剖結(jié)構(gòu)的測量建立兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型進行體內(nèi)生物陶瓷支架軟骨修復動物實驗觀察并評估軟骨修復效果從而找到適合體內(nèi)軟骨組織構(gòu)建的生物陶瓷支架。為ΒTCP材料進一步臨床應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復提供實驗依據(jù)?！痉椒ā恳贿x取二月齡健康新西蘭大白兔耳緣靜脈注射空氣栓塞處死取雙側(cè)股骨髁、肱骨及脛骨剔除周圍軟組織分別使用游標卡尺及64排CT重建進行測量獲取各項解剖數(shù)據(jù)。二消化分離成年兔肋軟骨細胞及關(guān)節(jié)軟骨細胞進行體外培養(yǎng)觀察兩種軟骨細胞的細胞獲得率、存活率、細胞貼壁率、形態(tài)學變化、MTT法測定細胞增殖速度并且進行甲苯胺蘭染色、亮綠番紅花“0”染色、二甲基亞甲基藍法測定硫酸糖胺多糖。從而優(yōu)選出適合軟骨組織工程研究的合適的軟骨細胞及其傳代數(shù)。三通過對肋軟骨細胞復合不同微結(jié)構(gòu)的生物陶瓷材料進行體外培養(yǎng)計算軟骨細胞在支架內(nèi)增殖生長的不同趨勢優(yōu)選出適合軟骨細胞生長的ΒTCP生物陶瓷支架的合適微結(jié)構(gòu)。四利用專利技術(shù)在前期研究的基礎(chǔ)上燒結(jié)出適合軟骨組織工程構(gòu)建的具有合適微結(jié)構(gòu)的ΒTCP生物陶瓷支架材料。五將體外實驗優(yōu)選的適合軟骨細胞生長的微結(jié)構(gòu)的ΒTCP生物陶瓷支架材料復合肋軟骨細胞植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中以驗證該微結(jié)構(gòu)修復動物體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性?！窘Y(jié)果】一解剖測量的結(jié)果得到了兔股骨髁、肱骨及脛骨的各項數(shù)據(jù)并且進行了CT三維重建測量結(jié)果顯示肱骨頭軟骨面至骺線距離45±02MM。脛骨內(nèi)側(cè)平臺寬度為61±04MM外側(cè)平臺寬度為64±03MM但脛骨平臺表面覆蓋有半月板組織無法進行手術(shù)顯露這兩個部位都無法滿足體內(nèi)試驗的需要。股骨內(nèi)側(cè)髁寬度為50±02MM外側(cè)髁寬度為40±01MM兩側(cè)髁的寬度都較小并且表面形態(tài)較不規(guī)整同樣不滿足體內(nèi)試驗的需要。股骨滑車寬度為65±05MM滑車近髁間窩表面軟骨至髓腔距離為91±06MM并且表面形態(tài)較規(guī)整可以適合體內(nèi)試驗的需要。二利用專利技術(shù)進行適合軟骨組織工程研究的合適微結(jié)構(gòu)ΒTCP生物陶瓷支架材料的燒制并且進行相關(guān)理化性能的表征檢測。三兩種軟骨細胞體外培養(yǎng)的結(jié)果顯示關(guān)節(jié)軟骨消化時間為649±187H細胞獲得率為579±17105100MG。肋軟骨消化時間為414±145H細胞獲得率為476±12105100MG肋軟骨細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞在細胞獲得率、存活率、貼壁率上都不具有統(tǒng)計學意義而肋軟骨細胞的消化時間卻低于關(guān)節(jié)軟骨細胞P值為00032。二甲基亞甲基藍法測定細胞傳代培養(yǎng)液中GAG的含量顯示1代軟骨細胞及2代軟骨細胞分泌GAG的量和原代細胞相似無統(tǒng)計學差異但從第3代軟骨細胞開始則開始具有統(tǒng)計學差異。四對軟骨細胞復合不同微結(jié)構(gòu)的支架材料培養(yǎng)的結(jié)果顯示培養(yǎng)第一周不同內(nèi)連接徑及孔徑的支架材料中種植的肋軟骨細胞的生長速度無明顯差異但是從第二周開始在孔徑相同的條件下內(nèi)連接徑120ΜM的支架材料生長速度明顯快于其他內(nèi)連接徑的支架材料這種情況一直延續(xù)到第四周。五進行體內(nèi)動物實驗認證結(jié)果證明肋軟骨細胞復合ΒTCP生物陶瓷材料可以修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損4月后的2代肋軟骨細胞組組織學評分為2076±213甲苯氨蘭、番紅及Ⅱ型膠原染色均顯示軟骨組織修復較為完全?！窘Y(jié)論】兔股骨滑車近髁間窩軟骨缺損的動物模型是有效的適合軟骨細胞組織工程研究。軟骨種子細胞優(yōu)選的結(jié)果發(fā)現(xiàn)肋軟骨細胞在體外生長速度較快分泌糖胺聚糖的量更多從體外擴增數(shù)量的角度出發(fā)2代軟骨細胞較適合軟骨組織工程構(gòu)建的需要。微結(jié)構(gòu)不同的生物陶瓷支架材料對肋軟骨細胞體外培養(yǎng)的結(jié)果是有差異的孔徑為500630ΜM內(nèi)連接徑120M的生物陶瓷材料體外培養(yǎng)較適合軟骨細胞體外生長的需要。體內(nèi)動物實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的復合方式軟骨修復結(jié)果是有差異的。肋軟骨細胞經(jīng)體外培養(yǎng)至2代后復合生物陶瓷支架材料修復動物關(guān)節(jié)軟骨缺損的結(jié)果較原代消化細胞直接復合支架材料修復動物關(guān)節(jié)軟骨缺損效果為好。硬質(zhì)生物陶瓷材料完全可以作為軟骨工程的支架材料。硬質(zhì)支架材料上層軟骨細胞成軟骨下層軟骨細胞則未成軟骨組織趨向轉(zhuǎn)化成骨。

簡介：點擊查看更多反求工程關(guān)鍵技術(shù)及其在髖關(guān)節(jié)生物形態(tài)分析與建模中的應(yīng)用研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：為了進一步提高文獻檢索系統(tǒng)的智能化水平，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學信息研究所近年來對基于文獻相關(guān)性判定的智能檢索系統(tǒng)進行了大量的研究，并且已經(jīng)摸索出一套實用的文獻相關(guān)性判定算法。生物醫(yī)學工程是二十世紀新興的一門交叉學科。作為二十一世紀的重點研究領(lǐng)域之一，該學科的文獻增長速度十分驚人。因此，建立生物醫(yī)學工程文獻智能檢索系統(tǒng)對于生物醫(yī)學工程專業(yè)研究人員來說具有十分重要的意義。為此，本研究在已經(jīng)取得的文獻相關(guān)性判定算法研究成果的基礎(chǔ)上，第一次將該算法應(yīng)用于實際的數(shù)據(jù)庫建設(shè)中，初步建立了中國生物醫(yī)學工程文獻相關(guān)性數(shù)據(jù)庫及其檢索系統(tǒng)。系統(tǒng)建好后，有關(guān)專家對系統(tǒng)判定出的相關(guān)文獻結(jié)果進行了評估和分析，分析結(jié)果顯示該系統(tǒng)判定的相關(guān)文獻集合具有較高的可信度，從而進一步地驗證了文獻相關(guān)性判定算法的正確性。另外，本研究還通過分析系統(tǒng)輸出的相關(guān)文獻和相似度結(jié)果，確定了中國生物醫(yī)學工程文獻相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的相似度閾值，并探討了中國生物醫(yī)學工程文獻相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的更新策略。

簡介：博士學位論文學校代碼10023學號B2012004003人小涎腺間充質(zhì)干細胞和上皮干／祖細胞分離鑒定及其構(gòu)建生物工程化唾液腺類器官的研究ISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFADULTSTEMCELLSHARBORINGINHUMANMINORSALIVARYGLANDSANDSTUDYONGENERATIONOFBIOENGINEEREDSALIVARYGLANDORGANOIDS所院整形外科醫(yī)院姓名呂磷指導教師趙振民教授導師小組學科專業(yè)研究方向完成日期趙振民尹寧北張智勇外科學整形外科與再生醫(yī)學2015年4月北_I協(xié)和醫(yī)學院博上學位論文縮寫B(tài)HABMPBRDUBSACMDILDABDAPIECMFBSG『FPHASCSHBMSCSHESCSHMSGMSCSHMSGSCSHTERTIBMXITSMTTODPBSI疆PRINRTPCRSFR英文縮略詞英文全稱BUTYLATEDHYDROXYANISOLEBONEMORPHOGENETICPROTEINBROMODEOXYUFIDINEBOVINESERUMALBUMINCHLOROMEHYLBENZAMIDODIALKYLCARBOCYANINEDIAMINOBENZIDINE46DIAMIDINO2PHENYLINDOLEEXTRACELLULARMATRIXFETALBOVINSERUMGREENFLUORESCENTPROTEINHUMANADIPOSEDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLSHUMANBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSHUMANEMBRYONICSTEMCELLSHUAMNMINORSALIVARYGLANDMESENCHYMALSTEMCELLSHUMANMINORSALIVARYGLANDSTEMCELLSHUMANTELOMERASEREVERSETRANSCRIPTASE3ISOBUTYL一1一METHYLXANTLLINEINSULINTRANSFERRINSODIUMSELENITE3一4，5一DIMETHYLTHIAZOL一2Y12，5DIPHENYLTETRAZOLIUMBROMIDEOPTICALDENSITYPHOSPHATEBUFFEREDSALINEREDFLUORESCENTPROTEINRNA2INTEGRITYNUMBERREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTIONSALIVAFLOWRATE

簡介：點擊查看更多工程菌生物轉(zhuǎn)化D-型氨基酸的研究——產(chǎn)D-海因酶工程菌的發(fā)酵條件與菌體細胞固定化.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多生物衍生骨—WO-1藥物緩釋系統(tǒng)在骨組織工程中應(yīng)用的實驗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：中國醫(yī)科大學碩士學位論文組織工程化人工角膜光學性和生物相容性的實驗研究姓名張旭申請學位級別碩士專業(yè)臨床醫(yī)學；眼科學指導教師李效巖201205物穩(wěn)定性和生物相容性的膠原植片作為組織工程化人工角膜的材料有很好的前景。關(guān)鍵詞組織工程，膠原交聯(lián)結(jié)構(gòu)，體外原代培養(yǎng)，光學性，生物相容性2

簡介：研究背景及研究目的各種原因所致的骨缺損在臨床上十分常見，其治療的關(guān)鍵在于獲取足量成骨活性好的骨修復材料。組織工程技術(shù)能夠在體外制備生物活性良好的骨修復材料，但組織工程骨廣泛應(yīng)用于臨床尚需解決一系列技術(shù)和工藝問題，包括種子細胞體外規(guī)?；瘮U增方法、擴增后生物安全性評估、種子細胞與支架材料高效均勻接種、大體積組織工程骨中心供養(yǎng)、如何降低組織工程骨中異種血清殘留量、組織工程骨的最佳體外培養(yǎng)時間和方式等。生物反應(yīng)器的合理應(yīng)用有望解決上述產(chǎn)業(yè)化問題，其中旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器ROTATINGWALLVESSELBIEACT，RWVB具有剪切力小、傳質(zhì)作用好等優(yōu)點，繞水平軸旋轉(zhuǎn)的RWVB在一定條件下還具備模擬微重力環(huán)境的特性。模擬微重力環(huán)境可使細胞、組織培養(yǎng)擺脫重力的影響，實現(xiàn)更接近體內(nèi)生存環(huán)境的三維培養(yǎng)，可能更有利于細胞體外增殖和組織成熟。本課題采用一種新型的RWVB旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)ROTARYCELLCULTURESYSTEM，RCCS在體外模擬微重力環(huán)境，并將其應(yīng)用到組織工程產(chǎn)品制備的種子細胞體外規(guī)模化擴增、組織工程骨的動態(tài)構(gòu)建和體外培養(yǎng)成熟三個方面，以觀察模擬微重力生物反應(yīng)器對種子細胞生物學特性、組織工程骨構(gòu)建效率及體外培養(yǎng)成熟的影響，并探索采用自體血清與牛血清序貫應(yīng)用策略以降低組織工程骨中異種血清殘留量的可行性，為探索高質(zhì)量組織工程骨的規(guī)?；苽浞椒ǖ於ɑA(chǔ)。實驗方法1、采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離健康志愿者紅骨髓、培養(yǎng)原代HMSCS，并對獲取的HMSCS進行表面標記物和多向分化潛能鑒定。2、以全程自體血清培養(yǎng)和牛血清培養(yǎng)作為對照，檢測自體血清對牛血清適應(yīng)性HMSCS的增殖和成骨分化影響。3、采用RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境，并結(jié)合CYTODEX3微載體培養(yǎng)HMSCS，通過形態(tài)學觀察、細胞計數(shù)、MTT及CCK8法觀察HMSCS的生長情況，檢測培養(yǎng)液中LDH活性及葡萄糖和乳酸濃度；并檢測該培養(yǎng)方式對HMSCS成骨誘導分化的影響。4、觀察RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境微載體法連續(xù)傳代培養(yǎng)HMSCS的增殖狀況和Β半乳糖苷酶染色檢測細胞老化狀況，體外連續(xù)培養(yǎng)4代后檢測細胞的致瘤性。5、采用HMSCS與DBM支架材料構(gòu)建組織工程骨，比較RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境中動態(tài)接種法與常規(guī)靜置接種和纖維蛋白凝膠雙相接種法構(gòu)建組織工程骨的細胞接種效率和上架細胞密度。6、觀察RCCS模擬微重力培養(yǎng)和常規(guī)靜置培養(yǎng)分別對組織工程骨中種子細胞的增殖和成骨分化的影響。7、采用裸鼠皮下異位成骨模型檢測不同構(gòu)建方法和不同體外培養(yǎng)時間的組織工程骨體內(nèi)成骨活性。實驗結(jié)果1、原代HMSCS接種后4D，可觀察到成纖維細胞樣的細胞集落，9至12D長滿單層培養(yǎng)瓶底，傳代細胞4至7D長滿單層；表達CDL05而不表達CD415；可誘導成軟骨分化；成骨誘導后堿性磷酸酶染色陽性，Ⅰ型膠原和骨鈣素免疫組化陽性，可形成礦化結(jié)節(jié)。2、牛血清后序貫使用自體血清培養(yǎng)HMSCS，其增殖和成骨誘導分化無顯著改變。3、在RCCS模擬微重力培養(yǎng)環(huán)境中，HMSCS能在CYTODEX3微載體表面附著生長，第9D細胞數(shù)量達到峰值；細胞計數(shù)、MTT法、CCK8法檢測結(jié)果提示平皿培養(yǎng)HMSCS對數(shù)生長期為第25D，細胞數(shù)量第6D達峰值時增長到378倍；微重力培養(yǎng)法HMSCS對數(shù)生長期為第28D，第9D達到細胞峰密度時細胞數(shù)量增殖119倍，單位培養(yǎng)液中細胞密度較平皿組增加158倍，葡萄糖消耗程度及LDH和乳酸濃度顯著比平皿組低。4、微重力組與平皿組HMSCS經(jīng)成骨定向誘導培養(yǎng)12D，單位細胞ALP活性均達到峰值，二者無顯著差異；兩種培養(yǎng)方法獲得的細胞堿性磷酸酶染色均為陽性，Ⅰ型膠原和骨鈣素免疫組化陽性，體外培養(yǎng)都可形成鈣結(jié)節(jié)，成骨誘導后HMSCS的增殖速度減慢。5、通過直接加入空白微載體的方法可實現(xiàn)RCCS微載體法培養(yǎng)HMSCS傳代培養(yǎng)，傳代細胞增殖速度略減慢，連續(xù)RCCS傳4代后HMSCS呈現(xiàn)陽性Β半乳糖苷酶陽性染色；連續(xù)傳四代RCCS培養(yǎng)57D，體外培養(yǎng)累計72D獲得的HMSCS染色體核型正常、軟瓊脂克隆形成試驗陰性、裸鼠致瘤實驗陰性。6、RCCS動態(tài)接種在110細胞塊及更高密度組比靜置接種法效率高，但該方法的接種效率和組織塊所含細胞密度均比FG雙相接種法接種效率低。7、RCCS動態(tài)培養(yǎng)法獲得的組織塊較常規(guī)靜置培養(yǎng)法獲得更高的細胞密度峰值，組織學觀察有更多細胞外基質(zhì)成分。雙相接種法以110細胞塊密度接種獲得的組織工程骨在RCCS中動態(tài)培養(yǎng)12D可達到最大細胞密度。8、在裸鼠皮下異位成骨模型中，X線攝片、組織學觀察、免疫組化染色證實雙相法高密度接種后經(jīng)過RCCS體外培養(yǎng)12D的組織工程骨比含相同數(shù)量種子細胞的或靜置法培養(yǎng)相同時間的組織工程骨都具有更好的成骨活性，以上3組材料均比單純DBM具有更好的體內(nèi)成骨效應(yīng)。結(jié)論1采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離人紅骨髓獲得的細胞在形態(tài)、表面標志、多向分化能力方面都符合HMSCS的特征，第2代HMSCS具有較高的純度和相當?shù)臄?shù)量，是骨組織工程較理想的種子細胞；自體血清對牛血清適應(yīng)性的HMSCS體外增殖和成骨誘導分化無不利影響。2采用微載體法在RCCS模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)HMSCS能實現(xiàn)細胞三維培養(yǎng)、提高細胞培養(yǎng)密度、提高培養(yǎng)液利用率、促進細胞快速增殖、實現(xiàn)無酶消化連續(xù)傳代、不影響成骨誘導分化、體外連續(xù)傳4代共57D仍無致瘤性，故該方法適合。HMSCS體外規(guī)?；瘮U增。3纖維蛋白膠雙相接種法與靜置接種法和RCCS模擬微重力動態(tài)接種法相比，顯著提高種子細胞與支架材料復合效率和組織工程骨中的種子細胞密度，可實現(xiàn)組織工程骨的快速高效構(gòu)建。4RCCS模擬微重力環(huán)境能促進種子細胞的物質(zhì)交換、提高組織工程骨中的種子細胞密度、促進種子細胞分泌細胞外基質(zhì)，采用該方法培養(yǎng)的組織工程骨具有較傳統(tǒng)靜置培養(yǎng)法和即刻構(gòu)建法獲得的組織工程骨具有更好的成骨活性。

簡介：種子細胞是組織工程最基本的要素軟骨細胞體外培養(yǎng)極易老化一般培養(yǎng)至56代其特異性標志蛋白Ⅱ型膠原就已經(jīng)喪失表達因此不能通過體外擴增獲取大量的軟骨細胞來滿足構(gòu)建軟骨組織的需要我們試圖通過基因轉(zhuǎn)染的方式建立永生化人關(guān)節(jié)軟骨細胞系并對其生物學特性進行研究從而為軟骨組織工程種子細胞的問題提供新的探索方向我們得出最后結(jié)論1、含HPV16E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠成功永生化人關(guān)節(jié)軟骨細胞2、永生化人關(guān)節(jié)軟骨細胞IHAC經(jīng)嚴格致瘤性檢驗為良性轉(zhuǎn)化3、通過3種不同的誘導方法可以快速穩(wěn)定地誘導并維持IHAC的Ⅱ型膠原表型4、IHAC在體內(nèi)具有優(yōu)秀的成軟骨能力

簡介：四川大學博士學位論文新型骨組織工程類細胞外基質(zhì)復合生物材料的研究姓名鄧霞申請學位級別博士專業(yè)口腔臨床醫(yī)學指導教師陳治清20060401●四川大學華西17腔醫(yī)學院博士學位論文縮略詞PEEAUNHACHCHDMFSEMXRDFTIREDXTEMDMEMMTTDMS0ODALPFCMCFEFECMSPBSHE縮略詞表英文全稱POLYETHERESTERAMIDEBASEDPOLYURETHANENANOMETERHYDROXYAPATITECHLOROFOITODIMETHYLFORMAMIDESCANNINGELECTRONMICROSCOPEXRAYDIFFRACTIONFOURIERTRANSFORMINFRAREDSPECTROMETRYXRAYENERGYDISPERSIVEMICROANALYSISTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPEDULLBECCO’SMODIFIEDEAGLEMEDIUM34，5DIMETHYLTHIAZOL一2Y1一2，5DIPHENYLTETRAZOLIUMBROMIDEDIMETHYLSULFOXIDEOPTICALDENSITYALKALINEPHOSPHATASEFLOWCYTOMETRYCASTINGFILMELECTROSPUNFILMEXTRACELLULARMATRIXPHOSPHATEBUFFEREDSALINEHEMATOXYLINANDEOSINSTAINING2中文名稱聚醚酯酰胺基聚氨酯納米羥基磷灰石氯仿二甲基甲酰胺掃描電鏡X射線衍射傅立葉紅外光譜儀X射線能譜分析透射顯微鏡DMEM培養(yǎng)液四唑鹽二甲基亞砜光密度值堿性磷酸酶流式細胞術(shù)溶劑澆鑄膜靜電紡絲膜細胞外基質(zhì)磷酸鹽緩沖液HE染色

簡介：黃酮類化合物是植物中種類最多、分布最廣的次級代謝產(chǎn)物家族，目前有超過9000種黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)。其具有較多藥理活性，例如抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、神經(jīng)保護等，此外，黃酮類化合物在化妝品、工業(yè)原料等方面也有重要的應(yīng)用價值，使得黃酮類化合物一直是研究熱點。根據(jù)結(jié)構(gòu)骨架，可以分為黃酮醇、黃酮類、黃烷酮類、異黃酮類、兒茶素類和花色苷類。匹諾塞林是一種廣泛存在于植物中的二氫黃酮類化合物，具有很好的生物活性，如神經(jīng)保護、抗菌、抗氧化等。在2009年，匹諾塞林被CFDA批準為Ⅰ類注射新藥，主要用于治療急性腦卒中，現(xiàn)已經(jīng)進入Ⅱ期臨床試驗階段。匹諾塞林的良好成藥性使其合成方法備受關(guān)注。匹諾塞林可以通過化學合成、植物提取和合成生物學技術(shù)進行制備。合成生物學技術(shù)是一種環(huán)境友好的工程化生物技術(shù)，代表未來匹諾塞林的合成發(fā)展方向。匹諾塞林的生物合成途徑中有三個關(guān)鍵酶對香豆酸輔酶A連接酶、查爾酮合酶、查爾酮異構(gòu)酶。由于查爾酮異構(gòu)酶具有空間選擇性，利用合成生物學技術(shù)制備的匹諾塞林為2S構(gòu)型，單立體異構(gòu)體對藥物的申報上市具有很重要意義。本論文還進行了法呢基焦磷酸合酶的研究。其作為一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，可以催化IPP和DMAPP生成法呢烯焦磷酸FPP，而FPP既參與合成倍半萜類化合物，也參與合成三萜皂苷和甾體皂昔等化合物，即FPPS處于單萜和倍半萜生物合成途徑分支處，是異戊二烯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。對法呢基焦磷酸合成酶的研究為虎眼萬年青NITHOGALUMCAUDATUM中萜類天然藥物生物合成途徑的重構(gòu)提供了必要的基因元件，為推動萜類天然藥物合成生物學的研究奠定基礎(chǔ)。本研究圍繞2S匹諾塞林的合成生物學制備，從虎眼萬年青中克隆得到了匹諾塞林生物合成途徑中的三個關(guān)鍵酶基因家族OSA4CL、OSACHS和OSACH1，進行了功能鑒定，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建工程菌，獲得了具有立體異構(gòu)體的（2S匹諾塞林，并研究了其藥理活性。主要取得如下結(jié)果1關(guān)鍵酶基因家族的克隆與表達通過對虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析，通過提取總MRNA，逆轉(zhuǎn)錄得CDNA，設(shè)計引物克隆得到匹諾塞林生物合成途徑中三個關(guān)鍵酶基因家族OSA4CL、OSACHS和OSACHI的UNIGENE，其中OSA4CL家族含有7條UNIGENE、OSACHS家族含有3條UNIGENE條和OSACHI家族含有1條UNIGENE，利用INFUSION原理構(gòu)建了原核表達載體，并進行誘導，實現(xiàn)了OSA4CL1、OSA4CL2、OSA4CL3、OSA4CL4、OSA4CL5、OSA4CL6、OSA4CL7、OSACHS1、OSACHS2、OSACHS3和OSACHI表達。2關(guān)鍵酶的功能鑒定在一條代謝通路通中，只有一個未知功能酶，若驗證該途徑是通暢的，則可以說明該關(guān)鍵酶具有活性。本文通過構(gòu)建工程菌的方法對已經(jīng)實現(xiàn)表達的關(guān)鍵酶進行功能鑒定，發(fā)現(xiàn)OSA4CL1、OSACHS2和OSSACHI具有功能。工程菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)波譜解析鑒定了結(jié)構(gòu)，特別是進行了圓二色譜的檢測，產(chǎn)物為匹諾塞林，且為單立體異構(gòu)體，是2S構(gòu)型。首次對微生物來源的2S匹諾塞林進行了藥理學活性檢測，實驗目前正在進行中。3工程菌的構(gòu)建及優(yōu)化圍繞已構(gòu)建工程菌產(chǎn)量問題，本文從以下幾點對工程菌進行優(yōu)化選取高活性關(guān)鍵酶、模塊化組裝和對關(guān)鍵酶基因進行密碼子優(yōu)化，即選擇紫花苜蓿來源的MSCH1，設(shè)計了三種模塊化組裝模式和對OSA4CL、OSACHS和MSCHI進行了密碼子優(yōu)化。三種模塊化組裝模式中只有第一種具有催化活性，在對密碼子進行優(yōu)化后，產(chǎn)量提高了166倍。4法呢基焦磷酸合酶的研究通過對虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析，得到了1327BP的法呢基焦磷酸合酶基因UNIGENE，通過F分析發(fā)現(xiàn)有1044BP開放閱讀框，命名為OSAFPPS通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其等電點是501，進化樹分析發(fā)現(xiàn)其屬于植物類FPPS家族。通過構(gòu)建表達載體進行表達后經(jīng)SDSPAGE電泳及WESTERNBLOT檢測，在體外酶促反應(yīng)后由GCMS法檢測，發(fā)現(xiàn)其可以催化IPP和DMPP。

簡介：創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因造成的四肢大段骨缺損是骨科臨床工作中常見而棘手的問題。當骨缺損的范圍超過了機體修復能力時，會引起肢體短縮、畸形，最終導致肢體功能障礙。為了解決大段骨缺損這一難題，人們嘗試使用異體骨、自體骨移植、骨骼延長術(shù)等多種方法來修復骨缺損，但因存在機體排異、傳播疾病、來源有限、產(chǎn)生新的創(chuàng)傷等問題而效果不佳。隨著生物學和材料學的發(fā)展，以這兩門學科為基礎(chǔ)的生物工程技術(shù)為解決這一臨床難題帶來了新的希望。該技術(shù)的關(guān)鍵要素包括具有成骨活性的功能細胞，有良好骨傳導性和骨誘導性的生物材料；主要技術(shù)路線將細胞與生物材料復合，細胞能夠在合適的條件下擴增、分化、分泌細胞外基質(zhì)，最終構(gòu)成具有活性的組織工程骨。與其他器官的組織工程技術(shù)一樣，在骨組織工程中不僅要模擬適合細胞生存的體內(nèi)環(huán)境，還要大幅度提高細胞培養(yǎng)、分化的效率，因此靜態(tài)培養(yǎng)模式遠遠不能滿足需要，必須借助生物反應(yīng)器來構(gòu)建活性人工骨。雖然目前已有多種面向骨組織工程的生物反應(yīng)器問世，但大多為構(gòu)建體積較小、外形簡單的組織工程骨而設(shè)計，缺乏適合構(gòu)建體積較大、結(jié)構(gòu)復雜活性人工骨的生物反應(yīng)器。本實驗以柱狀多孔磷酸三鈣生物陶瓷（ΒTCP）和兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCS）為研究對象，設(shè)計、制造了一種新的復合型灌注式生物反應(yīng)器，研究通過改進生物反應(yīng)器設(shè)計來提高體外構(gòu)建大體積活性組織工程骨效率的可行性。一、復合型灌注式生物反應(yīng)器的設(shè)計與制造目的構(gòu)建一種能在灌注室內(nèi)產(chǎn)生間歇性低壓的復合型灌注式生物反應(yīng)器，觀察其對長節(jié)段、多孔ΒTCP材料的灌注效果。方法組配式生物反應(yīng)器的主要構(gòu)件如BERZELIUS燒杯、鋁合金板材等材料均為市售，按照設(shè)計進行搭建。其結(jié)構(gòu)特點是蠕動泵驅(qū)動培養(yǎng)液在灌注室內(nèi)灌注支架的同時，自動控制的真空泵可以在灌注室內(nèi)產(chǎn)生間歇性低壓。用非永久性食用色素顆粒染色的柱狀ΒTCP分別在常壓和間歇性低壓環(huán)境中（001MPA，05HZ）以不同的灌注率進行灌洗，比較材料色素顆粒洗脫效果，以研究新的灌注環(huán)境對不同灌注率下材料內(nèi)灌注液行為的影響。結(jié)果常壓環(huán)境中，較高地灌注流量能更充分地洗脫顆粒，但在材料上半部仍有殘留；即使灌注率較低時，在間歇性低壓環(huán)境中的材料上所染的色素顆粒能更均勻地被洗脫。結(jié)論間歇性低壓環(huán)境可以影響灌注液流在長節(jié)段、柱狀多孔ΒTCP材料內(nèi)的行為，使低灌注率下灌注液在材料內(nèi)均勻分布，避免高灌注率對細胞的剪切力損傷。二、兔BMSCS材料復合方法的研究目的尋找一種簡單、高效的BMSCS與空心柱狀ΒTCP支架材料的復合方法，并且適于細胞材料復合體的進一步體外灌注培養(yǎng)。方法取10月齡新西蘭大白兔雙側(cè)股骨骨髓，反復貼壁法純化、培養(yǎng)BMSCS。使用第2代BMSCS制成1107ML、5106ML和1106ML細胞濃縮液，分別以01、02和10ML的體積緩慢滴注于柱狀ΒTCP材料內(nèi)部的管道中，分別記為方法A、B、C，記錄各組操作所耗時間。靜置兩小時后收集從材料中滲出的BMSCS并計數(shù)，計算各種方法的細胞材料復合率。結(jié)果在三組方法中，方法A、B最為快捷（213±013MIN、207±016MIN），操作C耗時較長（460±021MIN）；B組的細胞材料復合率最高（6433±220％），高于B、C兩組（5400±167％、5417±290％），以上差異均有統(tǒng)計學意義（P三、BMSCSΒTCP復合體在復合型灌注式生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)目的在復合型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)BMSCSΒTCP復合體，通過檢測代謝、成骨分化指標，觀察該生物反應(yīng)器的培養(yǎng)效果。方法將BMSCSΒTCP復合體分別進行靜態(tài)、常壓灌注和間歇性低壓灌注培養(yǎng)，記為對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ。各組均經(jīng)歷為期1周、2周、3周和4周四個階段的培養(yǎng)，定時收集培養(yǎng)液檢測葡萄糖日耗量、堿性磷酸酶比活性、骨橋蛋白水平，在各培養(yǎng)周期的終末行細胞活力（MTT）和硬組織切片檢查。結(jié)果在培養(yǎng)各時間點時，實驗組Ⅱ的日均葡萄糖消耗量和細胞活力均高于實驗組Ⅰ和對照組（P005）；實驗組Ⅱ中堿性磷酸酶比活性和骨橋蛋白水平最高，但其濃度曲線的高峰相均較實驗組Ⅰ和對照組推遲；硬組織切片檢查提示實驗組Ⅱ中細胞在材料內(nèi)的分布更均勻、占孔率更高。結(jié)論復合型灌注式生物反應(yīng)器制造和使用簡便，其設(shè)計理念適于構(gòu)建大體積、特殊構(gòu)型的活性組織工程骨。

簡介：采用組織工程技術(shù)建造生物性人工軟骨摘要在面中部或鼻基部區(qū)域，由于創(chuàng)傷、腫瘤或先天性畸形等原因，導致的局部軟骨缺損需要進行軟骨重建，以達到美觀和功能效果，而現(xiàn)有的治療方法不能滿足臨床軟骨缺損治療的需要，因此在現(xiàn)代頭頸外科領(lǐng)域，迫切需要新的治療方法對大塊軟骨缺損進行修復。而且由于至今沒有任何一種修復材料能夠完全達到或基本滿足人體對氣管移植物的條件要求，因此對喉和氣管缺損后如何進行修復重建，仍是醫(yī)學研究面臨的難題之一。由于自體肋軟骨和耳軟骨具有能夠保持移植活力、吸收少等優(yōu)點，因此在臨床上獲得廣泛應(yīng)用，但存在供體材料來源有限、需二次手術(shù)等缺點，而且自體肋軟骨移植有遠期鈣化傾向，從而限制了其臨床應(yīng)用。同種異體及異種軟骨移植物存在自溶現(xiàn)象、引起免疫排斥反應(yīng)以及傳播病原等限制，因而難以廣泛應(yīng)用。由于軟骨自身修復能力有限，而現(xiàn)有治療方法又不能完全滿足臨床需要，因此迫切需要科研人員嘗試新的技術(shù)和手段，對軟骨缺損進行治療。組織工程學是一門跨學科的新領(lǐng)域，它應(yīng)用工程學和生命科學的基本原理試圖建造能夠用于重建、維持或提高缺損組織功能的生物性人體組織。組織工程研究為臨床上修復因各種原因?qū)е碌能浌侨睋p帶來了希望。近年來，科研人員應(yīng)用國外研制的可生物降解聚合物作為支架，成功地在動物體內(nèi)培育出組織工程化人工軟骨，如耳形軟骨、鼻樣軟骨等，應(yīng)用國內(nèi)研制的支架材料成功進行軟骨再造的研究較少。本研究應(yīng)用國產(chǎn)支架材料，對采用組織工程技術(shù)建造生物性人工軟骨進行了研究，實驗主要包括以下三個部分1聚乙交酯丙交1酯泡沫材料的研制、物理性能檢測以及生物學評價。2軟骨細胞的分離培養(yǎng)、鑒定、生物學特性及軟骨細胞聚合物復合體體外培育的實驗研究。3采用組織工程技術(shù)建造生物性人工軟骨的實驗研究。研究結(jié)果簡述如下在第一部分，本研究采用溶媒投放、顆粒瀝濾技術(shù)制備了PLGA泡沫材料，并對PLGA泡沫材料的物理性能進行了測試。測試結(jié)果表明，應(yīng)用層壓技術(shù)研制可生物降解并具有一定解剖形狀及三維立體構(gòu)型的細胞支架材料，孔徑為180350ΜM，孔隙率為85％，基本上滿足了組織工程細胞支架材料的要求，具有潛在應(yīng)用前景。本研究還對采用層壓技術(shù)加工的三維多孔支架材料，通過細胞毒性實驗以及肌內(nèi)植入實驗，對PLGA支架材料生物相容性進行了檢測和評價，結(jié)果表明PLGA支架材料具有良好的生物相容性，從而為PLGA材料進一步作為軟骨細胞支架材料提供必要的實驗數(shù)據(jù)和安全性依據(jù)。在第二部分，首先獲取兔四肢，無菌條件下銳性分離關(guān)節(jié)表面的軟骨組織，然后參照KLAGSBRUN方法，應(yīng)用Ⅱ型膠原酶2MGML消化軟骨片斷，經(jīng)消化后所獲細胞在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，細胞長滿后進行傳代培養(yǎng)。通過細胞形態(tài)以及軟骨細胞特異性染色等手段，證實所培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞。原代培養(yǎng)的兔軟骨細胞可以進行傳代，細胞生長過程的穩(wěn)定期相對較長，約在第3代至第8代之間，細胞的生長特點較為穩(wěn)定，因此酶消化法是原代軟骨細胞培養(yǎng)較為理想的方法。在本研究中，在檢測細胞數(shù)和細胞活力后，將軟骨細胞懸液離心并濃縮成2X107細胞ML。隨后將軟骨細胞接種到支架材料上，形成的細胞支架復合體或者在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器內(nèi)RCCS培育，或者在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。不同時間取材后，進行大體和組織學分析，結(jié)果顯示在RCCS系統(tǒng)中培育的復合體有明顯軟骨形成，而后者在培養(yǎng)瓶內(nèi)僅有少量軟骨形成。上述結(jié)果表明RCCS系統(tǒng)2能夠為細胞生長提供最大限度模擬體內(nèi)生長的環(huán)境。在第三部分，本研究應(yīng)用層壓法將PLGA加工成具有顱骨樣、鼻軟骨樣形狀的片狀和具有軟骨環(huán)樣形狀的圓筒狀。從兔關(guān)節(jié)軟骨分離、培養(yǎng)軟骨細胞，濃縮后，密度為2X107個細胞ML。將軟骨細胞接種到PLGA支架上形成復合體，靜止放置4小時，以使細胞貼壁，隨后進行旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器或培養(yǎng)瓶內(nèi)培育，一周后分別將復合體植入到裸鼠背部皮下。術(shù)后定期取材，對標本進行大體和組織學分析。結(jié)果表明，經(jīng)RCCS培育過的細胞支架復合體在術(shù)后4周、8周，在外觀上形成了與聚合物支架形狀基本一致的軟骨組織，即呈現(xiàn)顱骨樣及鼻軟骨樣形狀新生軟骨，圓筒狀支架材料則形成了帶有氣管環(huán)樣形狀的氣管軟骨。在應(yīng)用各種檢測手段檢查后證明，所培育的新生組織為軟骨組織；在培養(yǎng)瓶內(nèi)培育的復合體在體內(nèi)植入術(shù)后各時間點，僅見有少量軟骨形成，且新生軟骨散在而未呈現(xiàn)出特定形狀。本研究結(jié)果不僅表明應(yīng)用PLGA支架能夠成功建造人工軟骨，而且表明RCCS能夠為復合體形成軟骨提供較為有利的外部環(huán)境。

簡介：研究目的了解構(gòu)建組織工程骨和組織工程骨膜過程中，人胚骨膜來源成骨細胞與生物衍生支架材料相互作用的分子生物學機制以及成骨細胞重要基因表達的變化，從基因水平預測骨組織工程代用品的生物安全性及有效性。方法選用人胚骨膜來源成骨細胞為種子細胞，接種于經(jīng)過脫蛋白、脫細胞處理的生物衍生支架材料上，分別培養(yǎng)2、4、6、8和10天。提取總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，采用實時定量PCR對目的基因Ⅰ型膠原COLI，骨鈣素OSTEOCALCIN，OC，成骨細胞特異轉(zhuǎn)錄因子CBFA1，成骨細胞特異基因OSTERIX以及整合素Α5Β1INTEGRINΑ5Β1進行擴增。在聚苯乙烯培養(yǎng)瓶中單純培養(yǎng)的成骨細胞作為對照組，在相應(yīng)時間點進行同樣的標本處理。結(jié)果①組織工程骨和單純培養(yǎng)的成骨細胞CBFA1的表達隨培養(yǎng)時間逐漸降低，其中2天組與10組，8天組與4、6、10天組比較，P＜005。組織工程骨膜組在培養(yǎng)中期CBFA1表達降低，其中2天組與4、6、8天組比較，10天組與4天組及8天組比較，P＜005。培養(yǎng)末期，組織工程骨CBFA1表達明顯高于生物膜組和對照組，P＜005。②組織工程骨及單純培養(yǎng)中OSTERIX表達的變化與CBFA1一致。組織工程骨膜中OSTERIX的表達隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高。培養(yǎng)早期和末期，組織工程骨OSTERIX的表達均高于對照組，P＜005。③COLI在兩個實驗組的表達隨時間均出現(xiàn)相類似的，較大的起伏變化。對照組表達則始終保持穩(wěn)定。④在2到6天中骨鈣素表達先下降，后回升。在培養(yǎng)末期，組織工程骨膜組骨鈣素表達升高，組織工程骨變化不明顯，對照組卻出現(xiàn)明顯的表達下調(diào)。⑤培養(yǎng)早期INTEGRINΑ5Β1表達呈陰性，INTEGRINΒ1組織工程骨中的表達略高于組織工程骨膜，具有統(tǒng)計學意義的差別僅存在于2天組和6天組。對照組中，INTEGRINΒ1穩(wěn)定，各時間段比較沒有統(tǒng)計學差異。結(jié)論①成骨細胞與生物衍生材料結(jié)合后，重要基因可持續(xù)正常表達。②組織工程骨中，成骨細胞CBFA1與OSTERIX表達高于組織工程骨膜組和對照組，而且兩個基因的變化一致，提示生物衍生骨作為支架材料，在保持成骨細胞性狀，誘導及促進成骨細胞分化方面有明顯優(yōu)越性。③成骨細胞與生物衍生材料結(jié)合后，以脈沖式產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，提示生物衍生材料不僅對細胞順利進入增殖狀態(tài)沒有影響，而且為細胞增殖提供廣闊而有效的空間。成骨細胞最終可以良好分化，充分發(fā)揮成骨功能。④生物衍生材料有利于成骨細胞黏附，但纖維連接蛋白并非必需的蛋白質(zhì)。

簡介：目的觀察凍存復蘇后組織工程化生物活性骨膜的生物學特性和成骨活性。方法從新西蘭大白兔骨髓中分離骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCS經(jīng)體外成骨誘導培養(yǎng)后與豬小腸粘膜下層SIS構(gòu)建組織工程化生物活性骨膜另外將未誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞和豬小腸粘膜下層也構(gòu)建組織工程化骨膜而后用含10％二甲基亞砜、50％胎牛血清、40％DMEM凍存液采用程序性降溫法將兩種工程化骨膜保存在196℃液氮中。30天后復蘇培養(yǎng)用MTT法檢測種子細胞在支架材料上的生長情況并用掃描電鏡觀察種子細胞的生長狀態(tài)通過免疫印跡的方法來檢測復蘇后組織工程骨膜分泌Ⅰ型膠原和骨鈣素量的變化酶組織化學法檢測堿性磷酸酶ALP分泌的量。結(jié)果凍存復蘇后BMSOS仍能在SIS上保持良好的生長狀況構(gòu)建的兩種組織工程化生物活性骨膜復蘇后在含有成骨誘導劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可分泌一定量的Ⅰ型膠原、骨鈣素和堿性磷酸酶。而且骨髓間充質(zhì)干細胞誘導為成骨細胞與小腸粘膜下層構(gòu)成的工程化骨膜M1所含的Ⅰ型膠原的量與未誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞和小腸粘膜下層構(gòu)建的工程化骨膜M2所含的量差異無統(tǒng)計學意義P005。但是M2所分泌的骨鈣素和堿性磷酸酶的量高于M1所分泌的量差異有統(tǒng)計學意義P結(jié)論組織工程化生物活性骨膜凍存復蘇后培養(yǎng)仍保持較穩(wěn)定的生物活性種子細胞在支架材料上附著生長并穩(wěn)定地分泌一定量的Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶和骨鈣素具有較強的成骨活性。M2表達成骨活性高于M1。