簡介：關節(jié)軟骨損傷是關節(jié)外科常見的疾病軟骨由于其自身的解剖特點，損傷后很難自愈，這也是導致關節(jié)疾病和關節(jié)不穩(wěn)的主要原因。目前，關節(jié)鏡下盥洗術、微骨折技術、馬賽克移植術等治療方法遠期效果均不滿意，最終導致關節(jié)軟骨的退變和骨性關節(jié)炎。采用自體軟骨細胞移植AUTOLOGOUSCHONDROCYTEIMPLANTATION，ACI能夠實現(xiàn)透明軟骨或透明樣軟骨修復，并取得較好的臨床療效。但ACI的缺點是供區(qū)出現(xiàn)新的缺損，需要二次手術，增加患者的痛苦。采用干細胞移植治療軟骨缺損是一個新興的治療手段，并認為間充質干細胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS是最有希望的干細胞。MSCS是具有自我復制和多向分化潛能的一類多能干細胞。目前，MSCS主要來源于骨髓，但獲得骨髓時造成患者的痛苦，且骨髓源性間充質干細胞BONEMARROWSTROMALCELLS，BMSCS隨著年齡增長其細胞數(shù)量和擴增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢，故尋找一種能替代BMSCS，并可彌補其缺陷干細胞來源，已越來越受到各國學者的關注。胚胎干細胞EMBRYONICSTEMCELLS，ESCS尚存在定向分化和純化的技術障礙，且面臨眾多倫理、法律方面的問題，也有移植后形成畸胎瘤的報道，應用受到一定限制。臍帶屬于胚胎外組織，是胎兒分娩后的廢棄物，組織來源廣泛，無倫理學限制。臍帶由臍帶外膜、臍動脈、臍靜脈以及血管周圍的黏蛋白樣組織，后者被稱為WHARTON膠。本研究目的為探討臍帶WHARTON膠中干細胞作為軟骨組織工程種子細胞的可行性，并從四個方面進行闡述。第一部分為人臍帶WHARTON膠中的基質成分定性和定量分析的實驗研究；第二部分為人臍帶臍帶WHARTON膠中MSCS的分離、培養(yǎng)及生物學性狀的實驗研究；第三部分人臍帶WHARTON膠中MSCS向軟骨誘導培養(yǎng)的實驗研究；第四部分為細胞因子在人臍帶WHARTON膠間質干細胞及其誘導產(chǎn)生的軟骨細胞的表達本研究從組織學、細胞學和組織化學、基因水平和蛋白表達水平探討臍帶WHARTON膠及WHARTON膠中MSCS的生物學特性和向軟骨誘導的可行性。方法1對臍帶組織進行組織化學和免疫組織化學染色，同時對WHARON膠進行葡萄糖胺聚糖GLYCOSAMINOGLYCANS，GAGS和總膠原含量的測定。2從手術臺取足月正常產(chǎn)健康產(chǎn)婦臍帶組織，去除臍血管和外膜組織，剝離WHARTON膠，采用膠原酶消化法和小組織塊兩種培養(yǎng)方法進行原代培養(yǎng)；對不同代的臍帶MSCS進行生長曲線、表面標志、流式細胞檢測表面標志、成纖維細胞集落生成單位COLONYFMINGUNITFIBROBLAST，CFUF、生長周期、凍存與復蘇及逆轉錄PCRREVERSETRANIONPOLYMERASECHAINRACTION，RTPCR分析，并進行番紅“O”染色、甲苯胺藍染色以及Ⅱ型膠原免疫組化染色進行軟骨特異性標志的鑒定。3在DMEM中加入10％FBS，10NGMLTGFΒ1，25NGMLBFGF，107M地塞米松作為誘導培養(yǎng)基。采用普通誘導培養(yǎng)、密集誘導培養(yǎng)、結合生物反應器技術體外構建無支架軟骨組織。成軟骨細胞表型通過番紅“O”染色、甲苯胺蘭染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色進行鑒別。GAGS定量檢測應用二甲基亞甲蘭法，Ⅱ型膠原定量檢測通過ELISA法。4分別對人臍帶WHARTON膠MSCS、向軟骨誘導培養(yǎng)后的MSCS以及人軟骨細胞進行細胞因子抗體芯片檢測，比較人臍帶WHARTON膠MSCS軟骨誘導前后與正常人軟骨細胞細胞因子表達水平，為同種異體移植奠定實驗基礎結果1人臍帶組織富含膠原和GAGS，HE染色發(fā)現(xiàn)WHARTON膠中含有大量的間質細胞；2采用酶消化法分離可以快速分離WHARTON膠中間質細胞，并迅速貼壁生長；采用組織塊法培養(yǎng)原代培養(yǎng)時間較長。流式細胞檢測表明這些細胞表達CD44、CD105、CD271等MSCS標志物；不表達CD34、CD45等造血等標志物；HLAABC陽性表達，HLADPDQDR陰性表達。經(jīng)過凍存復蘇后免疫表型無顯著變化。3未進行軟骨誘導的細胞弱表達軟骨細胞標志，誘導后GAGS和Ⅱ型膠原定量檢測結果均顯著高于未誘導細胞。RTPCR結果顯示人臍帶WHARTON膠MSCS誘導前后均表達SOX9、COL2AL人臍帶WHARTON膠MSCS經(jīng)密集誘導培養(yǎng)后迅速結成膜狀；采用密集誘導培養(yǎng)結合生物反應器培養(yǎng)體外可以構建大塊無支架組織工程軟骨。4采用細胞因子芯片技術對人臍帶WHARTON膠MSCS、誘導后的軟骨細胞以及正常軟骨細胞進行比較分析發(fā)現(xiàn)，臍帶WHARTON膠干細胞以及誘導后的軟骨細胞在軟骨相關因子表達水平與軟骨細胞接近；同時還表達腫瘤抑制生長因子以及某些神經(jīng)生長因子。結論1人臍帶WHARTON膠富含膠原和GAGS，具有與軟骨組織相似的細胞外基質；2人臍帶WHARTON膠中MSCS來源廣泛，無倫理學限制；臍帶MSCS具有間質干細胞的特性，不向造血系分化；3臍帶MSCS具有前軟骨細胞的特性，有望作為軟骨組織工程的新型的種子細胞。臍帶MSCS密集誘導培養(yǎng)結合旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可體外構建大塊無支架組織工程軟骨組織，有望作為新型體外構建軟骨組織的方法。4人臍帶WHARTON膠MSCS以及誘導后的軟骨細胞具有與軟骨細胞相同的表達譜，表明其更為接近軟骨細胞，是較好的軟骨組織工程的種子細胞來源。

簡介：目前，組織工程真皮材料依其成分可分為含有細胞和不含細胞兩大類。前者如DERMAGRAFF類，雖然它們在臨床試驗中都占有一席之地，但畢竟存在獲取較難、使用不便及潛在的抗原性等不利因素，而且值得注意的是，類似的這些組織工程皮膚產(chǎn)品雖然有些已在美國通過認證，如TRANSCYTE等，但在歐洲尚沒有得到認可。如此，不含細胞類的真皮替代物又開始逐漸受到了重視，這其中又主要包括脫細胞真皮替代物ADM和無細胞真皮替代物兩大類，但在ADM中，如ALLODERM也不能對抗原成分做到完全意義的去除，且來源有限、結構致密?？紤]到人工材料具有可塑性、可控降解性等優(yōu)點，本課題的研究目標即為采用生物高分子材料構建一種無細胞成分的組織工程真皮支架，并在本實驗室研發(fā)的新型戰(zhàn)傷止血材料明膠殼聚糖PVA材料的工作基礎上，對其工藝進行進一步改進，再結合種子細胞的有效培養(yǎng)上清成份即活性蛋白，使其不但在真皮的缺損重建方面更具優(yōu)勢，而且以其經(jīng)濟可靠、攜帶和使用方便的特點為戰(zhàn)傷急救敷料的進一步研究應用打下了較好的基礎。目的本研究制備的真皮缺損修復材料主要希望達到以下幾點①有良好的生物相容性，可塑性強，可促進受損真皮組織創(chuàng)面的愈合；②緩釋系統(tǒng)釋放的生物活性蛋白對真皮重建有促進作用；③簡單易用，成本較低，可用于平戰(zhàn)時的皮膚創(chuàng)傷急救。方法首先確定以明膠、殼聚糖、PVA為主要原料混合冷凍干燥制備復合材料的方法，并進一步依據(jù)材料的綜合性能優(yōu)化原料配比工藝并觀察研究其用于皮膚創(chuàng)傷模型的修復效果。另外，在成纖維細胞FB的培養(yǎng)上清中分析出有效的生長因子類活性組分并確定其大量提取的工藝，最后結合明膠微球緩釋系統(tǒng)以期制備成具有促愈合作用的急救類真皮修復材料。結果明膠、殼聚糖和PVA以5％∶2％∶5％濃度用8∶4∶1的比例混合凍干制備的復合材料有較好的修復效果，且MTT實驗結果顯示材料無明顯細胞毒性，為最終確定的真皮支架材料的制備方法；采用超濾離心法成功的提取了成纖維細胞培養(yǎng)上清中的有效活性蛋白，各種檢測結果表明，上清液中大于10KD的因子組合比較適于真皮FB的生長，尤其是10～30KD組對其促增殖的表現(xiàn)更有優(yōu)勢；而5～30KD的因子組合更適于對表皮細胞的生長，尤其5～10KD組對其單純的增殖有著明顯的促進作用；采用改良的乳化冷凝法制備了明膠微球GMS緩釋系統(tǒng)，對其一般性質進行了觀測，并發(fā)現(xiàn)其復合一定濃度的上清因子對FB有較好的持續(xù)促增殖的作用；在復合活性蛋白的支架材料對豬皮膚全層缺損修復作用的研究中，無論從大體觀察還是組織學觀察，實驗組不但較空白對照組愈合效果明顯，而且已接近自體皮膚移植組的愈合效果。結論明膠、殼聚糖和PVA以適當?shù)谋壤旌峡梢試L試作為真皮支架材料；＞10KD的成纖維細胞培養(yǎng)上清組分尤其對真皮的重建有積極的作用，復合控釋系統(tǒng)后克服了生長因子半衰期短，其進入體內(nèi)后迅速擴散、變性或酶解，應用效果不甚理想的弊病，既可避免毒副作用，又能加快上皮和結締組織生長；同時加入明膠殼聚糖PVA凍干材料這一載體進一步加強了對真皮缺損愈合的能力，使之為平戰(zhàn)時皮膚創(chuàng)傷修復的臨床應用奠定了一定的基礎。

簡介：背景與目的氧化亞鐵硫桿菌THIOBACILLUSFERROOXIDANSTF是1947年分離出來的新菌種這是一種專性自養(yǎng)及極端嗜酸性的硫桿菌它廣泛分布在土壤、海水、硫磺泉以及沉積泉中廣泛應用于低品位銅礦、鈾礦以及其他多種貴金屬的浸出和回收它是目前生物冶金中研究最多、最有經(jīng)濟效益的浸礦微生物。但是由于該菌生長緩慢、細胞得率低而且對鈾、氟等一些離子缺乏抗性所以在實際應用中限制了其應用范圍同時也對研究工作帶來很多不便。本實驗通過分子生物學技術克隆抗氟基因FLR4將其導入TF1中以期獲得穩(wěn)定遺傳的抗氟基因工程菌。方法1應用RTPCR技術從秀麗隱桿線蟲中克隆抗氟基因FLR4構建PET30AFLR4原核表達載體將其導入大腸桿菌BL21DE3中利用SDSPAGE及WESTERNBLOT檢測FLR4蛋白的表達通過生長動力學曲線檢測大腸桿菌抗氟能力的變化。2構建PJRD215FLR4載體將其導入大腸桿菌SM10后利用接合轉移技術將載體導入TF1檢測PJRD215FLR4的遺傳穩(wěn)定性比較野生型TF1和重組TF1菌株在不同氟離子濃度條件下生長動力學曲線。結果1克隆了抗氟基因FLR4構建了原核表達載體PET30AFLR4將其導入大腸桿菌BL21DE3后檢測到大腸桿菌中有特異性的融合蛋白的表達。野生型大腸桿菌BL21DE3在NAF為96GL的TB培養(yǎng)基中生長受到抑制而有融合蛋白FLR4表達的重組大腸桿菌BL21DE3其生長不受影響。2構建了PJRD215FLR4載體通過接合轉移導入TF1野生型TF1在NAF濃度為40MGL以上就不再生長而且在NAF濃度為20MGL時到達穩(wěn)定期時間為8天重組TF1在NAF濃度為60MGL的情況下仍能生長且在NAF濃度為20MGL的情況下到達穩(wěn)定期由原來8天縮短為4天。將重組TF1在無選擇壓力的條件下連續(xù)傳代50代質粒保留70％以上。結論1通過RTPCR技術從秀麗隱桿線蟲中克隆出抗氟基因FLR4構建了原核表達載體PET30AFLR4并將其轉入大腸桿菌BL21DE3中。2利用SDSPAGE和WESTERNBLOT技術檢測到融合蛋白FLR4在大腸桿菌BL21DE3中的表達并證實了抗氟基因的表達增強了大腸桿菌的抗氟能力。3構建了PJRD215FLR4表達載體通過接合轉移將載體導入到氧化亞鐵硫桿菌TF1中獲得了遺傳穩(wěn)定的抗氟基因工程菌TF1基因工程菌的抗氟能力提高了200以上。

簡介：目的骨誘導性CAP陶瓷具有臨床所期待的一系列優(yōu)良性能有希望開發(fā)成用途廣泛的材料該研究在課題組前期工作的基礎上從統(tǒng)計學水平進一步探討CAP陶瓷骨誘導性與動物種屬關系以及影響CAP陶瓷骨誘導性的材料學因素優(yōu)化選擇具有高骨誘導活性的CAP陶瓷并為骨誘導性材料的臨床應用提供更充分的理論和實驗依據(jù)同時重點研究骨誘導性CAP陶瓷構建體內(nèi)組織工程化骨及其在節(jié)段性負重骨缺損修復這一臨床亟待解決難題之領域應用的可行性摸索一套切實可行的修復方法結論1誘導成骨或類骨率、成骨量與材料理化特征及動物種屬關系有統(tǒng)計學差異陶瓷內(nèi)長入組織性質誘導成骨的形式膜內(nèi)或化生與材料的骨誘導性有關2材料骨誘導性與其對成骨細胞的黏附、增殖影響不完全一致即材料體內(nèi)外效應不一致提示與細胞復合的骨組織工程與利用材料骨誘導性的體內(nèi)骨組織工程對支架材料要求不完全一致3運用體內(nèi)組織工程的手段可構建血供良好具有一定力學強度體積足夠大的骨移植物在血管束周圍可形成帶血管蒂的游離骨移植物4應力分析與優(yōu)化設計具有優(yōu)良生物學性能的骨誘導性CAP陶瓷及輔助固定裝置在節(jié)段性負重骨缺損修復中應用可達到術中良好地恢復形態(tài)術后及早地重建功能實現(xiàn)骨缺損修復的主要目標有重要的理論和現(xiàn)實意義

簡介：該論文第一部分研究工作的主要成果在于1、針對生技霉素組分多，結構差異小，理化性質十分類似的特點，在該課題研究初期，探索出了有分離并富集不同極性組分效果的逆流分配方法和對極性類似組分具有良好效果的分離介質和溶劑繁育及組分檢測方法2、在以上工作基礎上，設計、實施了包括逆分配，堿性硅膠真空層析，柱層析，薄層制備層析等不同分離原理的單元操作，在獲得純品方面取得了很好效果，分別得到目標化合物3個。3、應用包括2DNMR及GC和GCMS的色譜質譜學的方法鑒定了7個生技霉素組分的結構4、歸納了快速鑒定生技坶素組分的光譜學方法，為極微量組分的HPLCMS，HPLCNMR分析打下了基礎5、根據(jù)反相高效液相RPHPLC，檢測了生技霉素中主要組分的含量6、改進并建立了快速分離生技霉素A的方法，滿足了臨床前藥理不的研究7、對生技霉素中試放大工藝流程進行了試驗，獲得了成功。研究人員開展了生物農(nóng)藥DKL活性組分的化學研究。論文第二部分研究工作的主要研究成果在于1、根據(jù)DKL有一低級醇溶性的特點，建立了醇水正相分離系統(tǒng)，利用活性追蹤，找到了活性成分2、建立了活性成分檢測的反相高效液相的條件3、利用DKL良好的水溶性，采用反相中壓柱分離的方法，獲得了純度達95％以上的純品DKL1和DKL24、應用光譜，質譜技術闡明了DKL1和DKL2的結構，DKL1為1ΑDC葡萄糖吡糖基4脫氧6乙酰基尿嘧啶，DKL2為尿苷5、活性成分DKL2的獲得為化學方法制定DKL效價方法和作用機制的研究打下了物質基礎，并為大規(guī)模生產(chǎn)和施用后，對產(chǎn)品質量及環(huán)境的監(jiān)控提供了依據(jù)7、促進了生物農(nóng)藥DKL的實用化。

簡介：點擊查看更多組織工程生物人工肌肉釋放重組治療性蛋白質的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多以臍帶沃頓膠制作新型生物軟骨支架并體外初步構建組織工程軟骨的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：該研究應用國產(chǎn)支架材料采用組織工程技術對人工膀胱組織的構建培育進行了初步實驗研究實驗主要包括以下三個部分1國產(chǎn)聚乙交酯丙交酯泡沫材料PLGA的生物相容性的實驗研究2膀胱組織工程種子細胞的實驗研究3采用組織工程技術建造生物性人工膀胱組織的實驗研究研究結果簡述如下第一部分國產(chǎn)聚乙交酯丙交酯泡沫材料的細胞毒性、組織相容性及降解率的測試與評價實驗第二部分膀胱移形上皮細胞與平滑肌細胞的分離培養(yǎng)、鑒定、生物學特性、及大量擴增的實驗研究第三部分細胞與材料復合體的構建和培育實驗該實驗對國產(chǎn)PLGA生物學特性的檢測實驗表明其作為膀胱組織工程研究的支架材料具有一定的可行性該實驗還摸索了膀胱移形上皮細胞與平滑肌細胞的培養(yǎng)與擴增條件再將培養(yǎng)擴增后的種子細胞接種到支架材料的內(nèi)外表面形成細胞材料復合體

簡介：內(nèi)毒素血癥是臨床創(chuàng)燒傷病人最常見的并發(fā)癥之一。作為基因工程抗體的SCFV片段已成為目前研究中最常用的一種抗體形式，它是一種線性的多肽，相對分子質量約為26KDA，是由重鏈的可變區(qū)VH和輕鏈的可變區(qū)VL通過一個柔性的肽段GLY4SER13連接而成的異二聚體，SCFV是針對特異性抗原的具有較高親和力的抗體片段的最小功能分子。與體積較大的抗體片段如FAB，F(xiàn)AB2和IGG相比，SCFV在非靶組織內(nèi)沉積較少，在血循環(huán)中的清除速度快以及更易滲透入靶組織內(nèi)，由于這些優(yōu)點使得SCFV具有廣闊的臨床應用前景。在SCFV制備過程中抗體庫的容量大小是決定能否篩選出高親和力抗體的關鍵因素，而核糖體展示技術則易于構建大容量的文庫庫容約10121013左右；減少細胞內(nèi)表達時所產(chǎn)生的差異性；更易產(chǎn)生突變，利于篩選出高親和力的抗體等。由于核糖體展示技術產(chǎn)生的文庫容量不受轉染的限制，因此更易于從抗體庫中篩選到抗原特異性SCFV。目的通過基因工程技術構建人源化SCFV抗體庫，采用核糖體展示技術在體外篩選與NHLBP有較高親合力的SCFV抗體及編碼的CDNA，在酵母細胞內(nèi)表達SCFV抗體并初步觀察該抗NHLBPSCFV抗體在體內(nèi)外的生物學活性。方法一、用含有人LBP與LPS結合活性部位的穿梭質粒PBACTLBP轉染SF21昆蟲細胞，獲得高滴度的重組病毒液；以此重組病毒液感染對數(shù)生長期的SF21昆蟲細胞進行表達，金屬親和樹脂純化含有NHLBP的培養(yǎng)上清，SDSPAGE電泳及WESTERNBLOT鑒定純化后產(chǎn)物。二、分離健康人外周血淋巴細胞，用RTPCR技術分別擴增抗體的VH和VL片段，將二者以SOEPCR方法通過一段柔性肽段GLY4SER13連接起來構成SCFV抗體文庫。三、應用PCR的方法使SCFV抗體庫帶上T7啟動子，AUG啟動子、一段KOZAK序列。運用核糖體展示技術在體外表達SCFV抗體文庫，表達產(chǎn)物轉膜檢測目的片段，同時用NHLBP標板篩選表達產(chǎn)物，篩選后的ARM復合體進行RTPCR反應，共進行5輪富集篩選。四、應用基因重組的方法將篩選到的編碼抗NHLBPSCFV抗體的CDNA與PPMETAA相連，轉入嗜甲醇畢赤酵母細胞PMAD11中，甲醇誘導表達后將細胞裂解上清純化鑒定。五、用所得SCFV抗體干預FITCLPS處理后的U937細胞，流式細胞儀檢測該抗體阻斷LPS與U937細胞的結合能力；同時用SCFV抗體干預燒傷合并內(nèi)毒血癥小鼠動物模型，觀察不同時相點1、3、6、12、24小時小鼠肝、肺、腎等臟器的形態(tài)學變化，檢測各組小鼠血漿中炎性細胞因子TNFA、IL6濃度的變化。結果一、經(jīng)過桿狀病毒表達系統(tǒng)SF21昆蟲細胞的表達、金屬親和樹脂純化和鑒定后獲得相對分子質量約為30KDA的NHLBP，總量約2624MG。二、從人外周血淋巴細胞中擴增出抗體的VH約340BP和VL片段325BP，連接后得到人源化SCFV抗體文庫片段大小約為750BP；將體外表達的SCFV抗體庫產(chǎn)物轉膜后檢測到相對分子質量約為27KDA的目的條帶，經(jīng)過5輪體外表達、富集篩選后得到編碼可與NHLBP高度結合的SCFV抗體的CDNA。三、編碼SCFV抗體的CDNA測序后在GENEBANK中進行序列比對，結果顯示序列中1811BP編碼抗體的VH，812856BP編碼LINKER，8571200BP編碼抗體的VL，所得編碼SCFV的CDNA序列正確。將核酸序列轉化為氨基酸序列后在GENEBANK中的IMMUNOGLOBINBLAST進行比對，顯示所得CDNA序列翻譯產(chǎn)物含有抗體的VH和VL部分。四、編碼SCFV抗體的CDNA轉染酵母細胞PMAD11，甲醇誘導表達72HRS后，細胞裂解上清經(jīng)SDSPAGE電泳及WESTERNBLOT鑒定，表達產(chǎn)物為相對分子質量約35KDA的SCFV抗體，總量約54062MG。五、FCM檢測所得SCFV抗體干預FITCLPS與U937細胞的結合能力，結果顯示較大量的SCFV抗體能夠抑制FITCLPS與U937細胞的結合，吸收峰處于基線水平。六、SCFV抗體干預燒傷合并內(nèi)毒素血癥小鼠動物模型后，與模型組相比觀察發(fā)現(xiàn)肝竇內(nèi)充血減輕、炎性細胞浸潤不明顯，肝細胞腫脹也明顯減輕；肺組織的炎性滲出和肺泡間隔的充血水腫減輕、炎細胞減少；腎組織內(nèi)毛細血管擴張、炎性細胞浸潤不明顯。血漿中TNFΑ濃度在燒傷合并內(nèi)毒素處理后即顯著增高，3HRS達到頂峰，隨后逐漸降低，模型組各時相點與對照組相比，差異有顯著性P＜001，P＜005。干預組與相應時相點的模型組相比，在最初3HRS內(nèi)TNFΑ濃度下降，差異有顯著性P＜005；3HRS以后差異不顯著P＞005。血漿中IL6含量在建模1HR即增高達到頂峰，3HRS以后的模型組IL6水平與對照組相比有顯著差異P＜001P＜005。SCFV干預后IL6的含量下降比較明顯，但除干預后6HRS組和同一時相點的模型組相比有顯著差異外P＜001，其余各組差異均無顯著性P＞005。結論一、運用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達、純化獲得了NHLBP；成功地從人外周血淋巴細胞中構建了人源化的單鏈抗體庫。運用核糖體展示技術對單鏈抗體庫進行體外翻譯、篩選，獲得了可與NHLBP高度結合的編碼SCFV抗體的CDNA，經(jīng)過序列分析比對符合SCFV的序列特征。二、應用嗜甲醇畢赤酵母表達系統(tǒng)和金屬螯合層析等方法表達純化出重組的抗NHLBP的SCFV抗體，相對分子質量約為35KDA。經(jīng)過體內(nèi)外生物學活性實驗顯示在細胞水平，人源化的抗NHLBPSCFV抗體能夠在一定程度上阻斷FITCLPS與U937細胞的結合。在體實驗結果表明燒傷合并內(nèi)毒素血癥小鼠經(jīng)SCFV抗體干預后血漿中炎性細胞因子TNFΑ和IL6的含量有所下降，部分內(nèi)臟器官的炎性改變減輕，提示該抗體對內(nèi)毒素血癥動物有一定的保護作用。三、本研究率先運用人源化基因工程抗體技術來研究內(nèi)毒素血癥的防治，首次在酵母細胞中表達獲得抗NHLBP的SCFV抗體。該研究結果將有助于進一步明確LBP在內(nèi)毒素生物學效應中的作用，可為內(nèi)毒素血癥和創(chuàng)燒傷感染的防治提供一條新的有效途徑。

簡介：外傷性腦損傷是全球性的多發(fā)性傷病也是死亡率和致殘率最高的傷病之一并且會造成嚴重的家庭和社會經(jīng)濟負擔。促進顱腦損傷后神經(jīng)修復與再生是當前研究的熱點和難點。腦的自我修復能力有限存在于腦組織中的內(nèi)源性干祖細胞對損傷的應答產(chǎn)生新的有功能的細胞能力有限而且受損的中樞內(nèi)微環(huán)境也不適合神經(jīng)組織的再生因此治療腦損傷的策略在于改善損傷局部的微環(huán)境使其適于神經(jīng)組織的修復同時移植入外源性細胞替代失去功能或死亡的細胞并與宿主細胞形成具有功能的整合改善神經(jīng)行為缺陷。受損傷腦組織的功能重建與局部血管網(wǎng)的重建、改善新陳代謝環(huán)境也關系密切。目前認為成體新血管的形成過程是血管生成和血管發(fā)生兩個過程的復合血管生成是毛細血管從膨大的小血管側長出的過程；而血管發(fā)生是通過血管內(nèi)皮祖細胞ENDOTHELIAPROGENITCELLEPCS原位形成血管。當腦組織受損缺失時組織空洞中移植入的神經(jīng)干細胞在沒有血管形成的情況下僅依賴損傷周邊區(qū)域的血管生成無法得到生存所需的充足養(yǎng)分如果有EPCS作為血管發(fā)生的原基而原位形成血管、則會大大有利于受損傷腦組織的結構與功能修復。當前的大部分腦損傷干細胞移植研究都缺乏對此問題的考慮也由此導致移植入的細胞生存率很低。本實驗擬通過移植入EPCS結合生物工程材料的方式促進腦損傷的組織空洞中血管網(wǎng)的重建。移植入的EPCS將充當新血管形成的底物并且運用旁分泌的方式促進血管生成。神經(jīng)干細胞NEURALSTEMCELLSNSCS具有自我增殖和分化能力能夠分化為神經(jīng)元和星形膠質細胞及少突膠質細胞等可以用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后移植替代失去功能或死亡的細胞移植入的細胞分化的神經(jīng)元能與宿主細胞形成具有功能的整合改善和恢復缺失的神經(jīng)功能移植入的細胞分化的星形膠質細胞可以通過產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)物質改善損傷局部的微環(huán)境并且為移植入的神經(jīng)元和損傷局部遷移再生的神經(jīng)元提供物理支撐使其適于神經(jīng)組織的修復而移植入的細胞分化的少突膠質細胞可能參與損傷局部的免疫反應。目前生物工程材料已經(jīng)廣泛使用在皮膚、骨骼、軟骨、血管、外周神經(jīng)及脊髓等組織缺損的再造和修復。組織工程策略目的在于提供種子細胞粘附的支架。本課題擬采用的生物工程水凝膠材料為移植物的基質材料其優(yōu)勢在于可注射性便于移植操作自動塑性適應性強適用范圍廣。本實驗擬在采用控制性腦皮質撞擊CONTROLLEDCTICALIMPACTCCI制作標準化的中度腦損傷模型的基礎上應用成體來源NSCS、EPCS聯(lián)合生物工程水凝膠材料進行腦損傷空腔內(nèi)移植以期能夠替代損傷缺失的腦組織細胞并且建立新的功能聯(lián)系恢復受損的神經(jīng)功能。目的獲取并體外擴增成年大鼠骨髓基質細胞BONEMARROWSTROMALCELLSBMSCS、脂肪來源干細胞ADIPOSETISSUEDERIVEDSTEMCELLSADSCS并分別向神經(jīng)干細胞NEURALSTEMCELLSNSCS及血管內(nèi)皮祖細胞ENDOTHCLIALPROGENITCELLSEPCS方向誘導分化分別檢測其表型及功能對比不同來源細胞的差異。方法取大鼠股骨、脛骨骨髓密度梯度法分離獲取BMSCS。取大鼠腰部白色脂肪組織Ⅰ型膠原酶消化法獲取血管基質片運用“DMEMF1210％胎牛血清FBS”擴增ADSCS。運用堿性成纖維生長因子BFGF、表皮生長因子EGF和N2等誘導成NSCS運用“低糖DMEM培養(yǎng)液108MOLL地塞米松5％FBS20NGML血管內(nèi)皮生長因子VEGF5NGMLBFGF5NGML胰島素樣生長因子IGF”配方的分化培養(yǎng)液誘導成EPCS。免疫熒光細胞化學和流式細胞術鑒定間充質干細胞MESENCHYMALSTEMCELLSMSCS、NSCS、EPCS的表面特征抗原。細胞計數(shù)檢測細胞增殖能力。通過乙酰化低密度脂蛋白ACLDL攝取和墨汁吞噬試驗、內(nèi)皮型一氧化氮合酶ENOSMRNA表達檢測、體外血管生成實驗等細胞功能方面檢測進一步確認誘導出的EPCS是否具有生理功能。結果體外可成功擴增大鼠成體來源BMSCS和ADSCS細胞呈長梭形以ADSCS胞體更長細胞排列更具方向性。BMSCS和ADSCS均能成功誘導出NESTIN陽性的NSCS并且在適當培養(yǎng)條件可以進一步誘導分化為GFAP、NEUN陽性細胞。通過本實驗設計誘導方案可成功將BMSCS和ADSCS誘導為EPCS細胞表型CD34、CD133、血管假性血友病因子VWF和FLK1并且兩種來源的EPCS增殖能力無差異。兩種細胞來源的EPCS均能攝取ACLDL而不吞噬墨汁ENOS的表達也與成熟的內(nèi)皮細胞無差異并且具有體外血管生成能力。結論MSCS能夠分離自大鼠成體骨髓和脂肪組織。它們均具有較強增殖能力并且能夠被誘導分化為NSCS和EPCS。誘導得到的EPCS是具有生理功能的細胞。目的體外檢測培養(yǎng)細胞與生物工程水凝膠材料的相互影響為體外培養(yǎng)細胞與生物工程水凝膠共移植治療提供理論依據(jù)。方法選擇兩款不同組分的水凝膠MATRIGEL和PURAMATRIX作為實驗材料以前述方法獲得的EPCS作為檢測細胞將EPCS培養(yǎng)于不同濃度的MATRIGEL10％、20％、30％或PURAMATRIX025％、05％、1％表面或與不同濃度的MATRIGEL或PURAMATRIX混懸培養(yǎng)于培養(yǎng)的不同時間觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)并用ALAMARBLUE法檢測細胞的增殖情況以確定材料的細胞毒性。觀察EPCS在水凝膠中的成管化狀態(tài)以檢測細胞是否仍具有生理功能。將前述方法獲得的NSCS與最佳濃度的水凝膠共培養(yǎng)觀察細胞的生長情況用免疫細胞化學法檢測其分化情況。結果三種濃度MATRIGEL中30％的MATRIGEL細胞毒性較大而三種濃度的PURAMATRIX中1％的PURAMATRIX細胞毒性較大。EPCS培養(yǎng)于MATRIGEL表面較混懸其中的細胞增殖率高而且此差異隨MATRIGEL的濃度增高而增強。EPCS在20％和30％的MATRIGEL表面培養(yǎng)均能成管化在10％的MATRIGEL表面和混懸其中培養(yǎng)7天多數(shù)細胞沉底。20％的MATRIGEL中培養(yǎng)7天能夠立體成管化。而30％的MATRIGEL中EPCS僅能伸出少數(shù)突起不能成管化。PURAMATRIX在025％和05％的濃度時EPCS培養(yǎng)于PURAMATRIX表面與細胞混懸其中的細胞增殖率相比無明顯差異；而在1％時EPCS培養(yǎng)于PURAMATRIX表面和混懸其中存活率均很低。EPCS在025％和05％的PURAMATRIX表面培養(yǎng)細胞能夠穿入PURAMATRIX中。而在025％的PURAMATRIX中培養(yǎng)細胞可附著于材料上但較難成管化05％的PURAMATRIX中培養(yǎng)7天能夠成管化。三種細胞密度相比107個ML的細胞密度EPCS更容易體外成管化。NSCS在水凝膠中能夠遷移分化并且05％PURAMATRIX較20％MATRIGEL中細胞向神經(jīng)元樣細胞分化比例較高。結論MATRIGEL和PURAMATRIX在適當?shù)臐舛?0％MATRIGEL和05％PURAMATRIX均能與培養(yǎng)細胞良好的相容并且起到支撐作用模擬正常生理狀態(tài)給細胞提供一個三維生長環(huán)境并且能夠促進NSCS細胞分化。由于PURAMATRIX為人工合成肽產(chǎn)物降解產(chǎn)物無毒性可能是更適合移植的生物材料。目的觀察體外擴增的干、祖細胞及生物工程水凝膠材料共同移植對腦損傷后的神經(jīng)功能恢復的影響。方法健康成年WISTAR近交系大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、生理鹽水移植組、單純水凝膠移植組、EPCS聯(lián)合水凝膠移植組、NSCS聯(lián)合水凝膠移植組、NSCS和EPCS聯(lián)合水凝膠移植組。采用改良自由落體撞擊腦損傷模型損傷7天時于原損傷區(qū)行移植術分別于動物造模成功后6天、移植術后1、2、3、4周進行肢體運用不對稱試驗、運動評價移植術后30天行水迷宮實驗。移植35天處死實驗動物完整取腦常規(guī)石蠟固定包含損傷灶的腦組織行連續(xù)冠狀位切片。HE染色后計算損傷所致空腔體積分析各組損傷恢復情況。FITCDEXTRAN灌注觀察損傷局部血管分布情況。免疫組織熒光化學法染色分析移植細胞的存活和遷移情況以及損傷灶局部組織修復的病理改變。結論體外擴增NSCS、EPCS及生物工程水凝膠材料共移植有促進局灶性腦外傷大鼠神經(jīng)功能恢復的作用其中生物工程水凝膠材料能夠為移植細胞提供物理支持和攀附支架EPCS能夠參與損傷局部的血管重建改善損傷局部的微環(huán)境有利于損傷修復NSCS能夠分化為神經(jīng)元補充腦損傷的神經(jīng)缺失細胞結合生物工程材料的移植體是腦損傷修復的較佳。

簡介：目的探討脫細胞羊膜基質的生物相容性和細胞相容性。論證其作為新的骨組織工程3D基質候選物的可行性。方法將成骨細胞MC3T3E1種植在脫細胞羊膜上，用ΑMEM常規(guī)培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡和掃描電鏡下觀察細胞的形態(tài)、存活時間以及細胞分布、排列情況。使用免疫熒光和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察FAK、PAXILLIN、INTEGRIN表達和分布情況。結果種植后12小時MC3T3E1細胞在羊膜基質上粘附，3天長滿基質。7天后，細胞分泌細胞外基質。細胞聚集成團簇樣復層生長，簇間以細胞條索相互交通。且在同一時期細胞形態(tài)多樣化，包括雙極、多極和球形。21天時細胞開始調亡。在細胞存活時期內(nèi)，細胞表達FAK紅熒光、PAXILLIN綠熒光、INTEGRIN綠熒光蛋白。主要存在細胞膜上。免疫熒光雙標FAK、PAXILLIN和FAK、INTEGRIN，在細胞膜上出現(xiàn)強共聚焦表現(xiàn)為黃色熒光。結論1MC3T3E1細胞在羊膜基質上以常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)可以存活3周，并聚集成簇復層排列，相互溝通。2MC3T3E1細胞可以分泌細胞基質，在同一時段出現(xiàn)不同細胞周期階段的細胞共同存在的現(xiàn)象。3MC3T3E1細胞和脫細胞羊膜以3D粘附方式相連接。本研究提示羊膜基質有可能成為骨組織工程的新型的3D基質候選物。

簡介：靜電紡絲技術能夠直接、快速、連續(xù)的制備聚合物納米纖維，已成為目前制備納米纖維支架的主要方法之一。通過靜電紡絲技術制備的組織工程支架具有以下特性1模擬原生細胞外基質ECM的拓撲結構，使支架具有較高的孔隙率和比表面積，能夠支持內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和纖維原細胞的黏附和分化；2通過調節(jié)紡絲溶液的性質和紡絲過程的工藝參數(shù)，可以得到不同形貌和直徑的納米纖維，滿足不同組織的要求；3既可以選擇合成材料也可以選擇天然材料，或者將兩者混合紡絲，得到力學性能和生物性能良好，能夠滿足不同需求的支架?；谝陨溪毺貎?yōu)勢，靜電紡絲技術成為制備組織工程支架研究的熱點。本文首先通過本體聚合的方法合成了高分子量可降解聚合物乳酸羥基乙酸共聚物PLGA，然后利用靜電紡絲技術制備出絲素蛋白SF和PLGA復合納米纖維支架。研究了紡絲液濃度、紡絲電壓、體積流率、接收距離和SFPLGA質量比對纖維形貌結構的影響；采用乙醇浸泡的方法提高了纖維支架在水中的穩(wěn)定性；利用掃描電子顯微鏡SEM、傅里葉變換紅外光譜FTIR研究了乙醇處理前后纖維支架的形貌和二級結構的變化；研究了乙醇處理前后力學性能、水接觸角、水溶失率和孔隙率的變化；通過臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECS在支架表面的培養(yǎng)研究了生物相容性。實驗結果表明在140℃溫度下，乙交酯和丙交酯在氮氣保護下反應24H可以生成分子量MΗ≈14105符合靜電紡絲要求的PLGA。經(jīng)過探索得到了SFPLGA混合紡絲的理想?yún)?shù)SFPLGA濃度為10％，紡絲電壓為15KV，體積流率為03MLH，接收距離為15CM。乙醇處理后，SF分子由無規(guī)卷曲結構轉變成Β折疊構象，纖維直徑增大，支架的孔隙率略有下降，支架在水中的穩(wěn)定性提高，力學強度增加。SF能有效改善紡絲支架的親水性和內(nèi)皮細胞在支架表面的粘附和增殖。因此乙醇處理后的SFPLGA復合支架具有良好的生物相容性，在組織工程領域具有很好的應用前景。

簡介：本研究分為二部分第一部分絲素蛋白無紡網(wǎng)的生物相容性研究目的以家蠶絲為原料制備出制備絲素蛋白無紡網(wǎng)NONWOVENSILKFIBROIN，NWSFN支架，并對其進行生物相容性評價。方法通過簡單的方法將家蠶絲制成絲素蛋白無紡網(wǎng)支架，并進行掃描電鏡觀察其形態(tài)。根據(jù)ISO10993、國家標準GBT16886和文獻資料對該支架材料進行生物相容性評價①急性全身毒性實驗實驗組小鼠按50MLKG劑量經(jīng)腹腔注射材料生理鹽水浸提液，對照組以同樣劑量經(jīng)腹腔注射生理鹽水，注射后4H、24H、48H、72H觀察和記錄小鼠狀態(tài)、中毒癥狀和死亡數(shù)目以了解其對全身的影響；②體外細胞毒性實驗采用噻唑藍MTT法計算HELA細胞相對增值率RGR來評價材料的細胞毒性；③植入后短期局部反應實驗將支架材料和不可吸收縫線分別植入小鼠左右側背部皮下，分別于1周、2周、3周、4周后取材進行石蠟包埋、切片、HE染色，觀察其引起的組織反應。結果①材料形態(tài)特征制備好的材料成白色片狀，電鏡顯示其成三維網(wǎng)狀，無絲膠及其他雜質殘留，絲素蛋白纖維的平均直徑約9～15ΜM；②急性全身毒性實驗實驗組小鼠一般狀況良好，無急性全身毒性癥狀；③體外細胞毒性實驗材料的毒性評級為0～Ⅰ級，屬無毒范疇；④短期植入后局部反應實驗植入后材料周圍炎性反應輕微且局限。結論絲素蛋白無紡網(wǎng)具有良好的生物相容性，有可能成為理想的天然組織工程支架材料。第二部分以絲素蛋白無紡網(wǎng)為支架體外構建組織工程化軟骨目的探討以絲素蛋白無紡網(wǎng)NONWOVENSILKFIBROIN，NWSFN作為耳廓軟骨細胞外支架體外構建組織工程化軟骨的可行性。方法取成年新西蘭兔耳廓軟骨，酶消化法獲取軟骨細胞，體外培養(yǎng)擴增后取原代細胞接種到制備好的絲素蛋白無紡網(wǎng)支架上，體外復合培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞粘附、生長、增殖情況。于復合培養(yǎng)后第3、7、10天時取材進行掃描電鏡觀察，于復合培養(yǎng)第1、2、4、6周取材進行組織學評價和通過RTPCR方法檢測復合物上軟骨細胞Ⅱ型膠原MRNA的表達情況。結果復合培養(yǎng)24H后大部分軟骨細胞已粘附于絲素蛋白纖維上，72H后細胞開始分泌少量細胞外基質EXTRACELLULARMATRIX，ECM，且細胞支架復合物透光度降低；電鏡下觀察顯示軟骨細胞及分泌的薄層細胞外基質主要分布于支架材料淺層，支架內(nèi)部細胞及基質甚少。組織學觀察亦顯示軟骨細胞及細胞外基質主要分布于支架淺層，支架內(nèi)部僅有少量細胞及散在基質分布，2周時支架淺層已有一定厚度的細胞外基質，可見少量軟骨陷窩，4周和6周時支架淺層細胞外基質更多，軟骨陷窩也增多，而支架內(nèi)部軟骨細胞數(shù)目和基質僅少量增加。RTPCR檢測顯示在各檢測時間點標本均有Ⅱ型膠原MRNA的表達。結論兔耳廓軟骨細胞在絲素蛋白無紡網(wǎng)支架上已初步形成軟骨樣組織，但培養(yǎng)條件應進一步優(yōu)化。

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簡介：近年來，隨著組織工程和神經(jīng)科學的迅猛發(fā)展，應用組織工程學原理和技術方法制備具有特定三維結構和生物活性的支架材料修復周圍神經(jīng)缺損成為一種創(chuàng)新的研究和可能有效的治療方法。任何生物材料應用于人體之前，都必須經(jīng)過嚴格檢驗，除需符合要求的機械及理化性能外，還要有各種安全性和有效性數(shù)據(jù)資料。多年來，我國有關單位認真參考ISO／10993系列標準，制定并公布執(zhí)行了我國有關醫(yī)療器械生物學評價的國家標準GB／T16886ISO10993系列，保證了植入性醫(yī)療器件、人工器官的質量和在臨床應用的安全性、有效性。GB／T16886ISO10993系列標準是我國醫(yī)療器械生物學評價的基本準則和指南，具有較高權威性。本實驗以本課題組已獲國家專利的方法制備新型組織工程神經(jīng)支架材料，并以此材料為研究對象，參照GB／T16886ISO10993所規(guī)定的原則和實驗方法，對材料進行了較為全面、系統(tǒng)的生物安全性評價，以期為該材料下一步臨床應用的安全性提供有價值的理論依據(jù)。實驗第一部分是新型組織工程神經(jīng)支架材料的制備及其體外細胞毒性實驗。按照本課題組已獲專利的方法、以膠原和明膠為原料制備新型組織工程神經(jīng)支架材料，并以戊二醛為交聯(lián)劑進行交聯(lián)改性。按體外細胞毒性實驗要求制備受試物及其浸提液，以直接接觸法及浸提液（MTT）法檢測材料細胞毒性。結果表明材料對小鼠L929成纖維細胞無直接毒性作用，其浸提液對細胞各時限的毒性評定級別均為0～1級，對細胞形態(tài)、生長和增殖不構成損害，具有良好的細胞相容性。實驗第二部分是新型組織工程神經(jīng)支架材料的生物安全性評價之動物實驗部分。根據(jù)GB／T16886IS010993醫(yī)療器械生物學評價標準和實驗方法，分別對材料進行了皮膚刺激實驗、遺傳毒性（小鼠骨髓細胞微核）實驗、植入后局部反應實驗、急性全身毒性實驗（分別經(jīng)靜脈、口服和腹腔三種途徑給予）、慢性全身毒性實驗、熱原實驗和溶血實驗。實驗結果表明該支架材料無急、慢性全身毒性作用，無皮膚刺激性及潛在致突變性，無熱原性，有良好的組織相容性和血液相容性。結論本研究所制備的支架材料具有良好的細胞、組織和血液相容性，已達到生物安全性初級檢測、第二階段實驗及臨床應用前實驗的要求，本研究為其臨床應用的安全性提供了較為翔實、可靠的實驗依據(jù)。