BmK CT活性位點(diǎn)分析及其抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤遷移的研究.pdf

1、東亞鉗蝎(Buthus martrnsii Karsch，BmK)氯離子通道毒素(BmK CT)是一個(gè)由36個(gè)氨基酸組成、含4對(duì)二硫鍵的短鏈神經(jīng)毒素蛋白，與從以色列蝎（Leiurusquinquestriatus）中分離得到的氯離子通道毒素chlorotoxin(CTX)有68％的同源性，它們有相似的生物學(xué)功能，可與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上特異表達(dá)的氯離子通道和上調(diào)表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)結(jié)合，從而抑制其遷移。
　　本研究

2、在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)BmK CT結(jié)構(gòu)建模及分子表面靜電勢(shì)分析工作的基礎(chǔ)上，研究BmK CT中堿性氨基酸殘基對(duì)其功能的影響，判斷BmK CT與其受體MMP-2作用的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。通過構(gòu)建相互作用的分子模型，闡明蝎氯毒素作用其受體從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞擴(kuò)散的分子機(jī)制，找到功能位點(diǎn)和活性表面的重要?dú)埢?，深化蝎毒素的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系研究。同時(shí)，本研究采用定點(diǎn)突變、蛋白表達(dá)純化、WesternBlot分析、圓二色光譜分析、細(xì)胞劃痕擦傷實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜等實(shí)驗(yàn)

3、技術(shù)，并輔助以上計(jì)算機(jī)3D復(fù)合物結(jié)構(gòu)建模加以分析。實(shí)驗(yàn)上，得到了電泳純的野生及突變體蛋白，每升LB培養(yǎng)液可獲得目的蛋白0.2～1.34 mg。圓二色光譜分析結(jié)果表明，BmK CT及其突變體蛋白在208 nm的θ（橢圓率）值的絕對(duì)值大于222 nm處，表明突變體蛋白都是以α-helix+β-sheet型存在的，與野生型BmK CT的結(jié)構(gòu)類型相同。劃痕擦傷遷移實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)突變體蛋白濃度為0.15μM作用8h時(shí)，BmK CTR14K15AA、B

4、mKCTR17A對(duì)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的遷移抑制率約為10％左右，明顯低于BmK CTK25A、BmKCTR35A對(duì)C6細(xì)胞的遷移抑制率。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)中，BmK CTR14K15AA、BmK CTR17A處理組的MMP-2條帶亮度高于BmK CTk25A、BmKCTR35A處理組，說明R14K15、R17三個(gè)堿性殘基位點(diǎn)對(duì)于BmK CT發(fā)揮抑制MMP-2的活性起重要作用。本文通過分子建模和表面靜電勢(shì)分析表明，BmKCT及突變體分子表面

5、的正電勢(shì)與其受體MMP-2催化結(jié)構(gòu)域的負(fù)電勢(shì)具備通過靜電相互作用的條件，且位于BmKCT中α-helix結(jié)構(gòu)上的R14、K15、R17殘基對(duì)維持整個(gè)分子表面的負(fù)電勢(shì)較為重要。在BmK CT及其突變體與受體MMP-2催化結(jié)構(gòu)域?qū)訌?fù)合物模型分析中，我們以復(fù)合物的靜電作用能和氫鍵的結(jié)合情況來分析BmK CT及突變體與MMP-2的親和能力，BmK CTR14K15AA、BmKCTR17A與受體MMP-2催化結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的靜電作用能的絕對(duì)值和兩

6、者之間的氫鍵個(gè)數(shù)為五個(gè)復(fù)合物中最小的，從親和力方面解釋了其空間結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性導(dǎo)致其抑制MMP-2活性的原因。綜合上述實(shí)驗(yàn)和理論兩個(gè)方面，證實(shí)了R14、K15、R17位點(diǎn)為BmK CT中關(guān)鍵的堿性氨基酸位點(diǎn)，對(duì)BmK CT發(fā)揮抑制MMP-2活性有至關(guān)重要的影響。
　　本研究利用Swiss-Model、ZDOCK服務(wù)器及InsightⅡ2000軟件包，構(gòu)建了以氯通道毒素空間結(jié)構(gòu)為骨架優(yōu)化設(shè)計(jì)的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的高特異性的蛋白質(zhì)分

7、子序列和模型。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過對(duì)BmK CT基因的定點(diǎn)突變、原核細(xì)胞表達(dá)及純化，獲得了以上經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬優(yōu)化的蛋白，命名為Op-BmK CT。細(xì)胞擦傷劃痕實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)Op-BmK CT蛋白作用濃度為0.12μM、處理時(shí)間為20h時(shí)，處理組劃痕兩側(cè)的細(xì)胞向中間生長(zhǎng)，劃痕寬度明顯變窄，遷移抑制率約為62％;而當(dāng)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)30 h時(shí)，隨著培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)消耗及蛋白與細(xì)胞表面受體作用效果的降低，Op-BmK CT處理組與BmK CT處理組的抑制率均表現(xiàn)下降趨

8、勢(shì)，但Op-BmK CT處理組的抑制率高于BmK CT處理組約1倍左右，推測(cè)是由于優(yōu)化蛋白在總能量、表面靜電作用能等方面比對(duì)照組更穩(wěn)定，從而表現(xiàn)出優(yōu)化蛋白在抑制遷移方面的優(yōu)越性，實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了前期我們通過計(jì)算模擬構(gòu)建的這個(gè)蛋白在抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移方面比野生型的活性更高。此外，紅色熒光納米鉆石顆粒(Fluorescent nanodiamonds，F(xiàn)ND)因具有化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性、表面易修飾、無毒性、光學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，所以非常適合做

9、生物標(biāo)記和藥物的輸送載體。本研究通過化學(xué)反應(yīng)將BmK CT與FND偶聯(lián)，探討由FND介導(dǎo)的BmK CT抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤遷移的新途徑，以期通過BmK CT與MMP-2的結(jié)合、FND介導(dǎo)的胞吞作用將神經(jīng)膠質(zhì)瘤表面的MMP-2胞吞回細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到降低遷移率的目的。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)FND-BmK CT濃度為5μg/ml時(shí)，通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)存在紅色熒光顆粒，表明MMP-2介導(dǎo)的FND-BmK CT通過細(xì)胞內(nèi)吞作用可進(jìn)入

10、C6細(xì)胞。劃痕擦傷遷移實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ND-BmK CT對(duì)C6細(xì)胞的抑制率較高約為32％，略高于FND和BmK CT處理組。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和劃痕擦傷遷移實(shí)驗(yàn)都證明偶聯(lián)納米顆粒FND的BmK CT能夠抑制C6細(xì)胞的遷移，此研究為FND-BmK CT抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤納米靶向制劑的研發(fā)奠定理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究從分子作用機(jī)制層面闡明蝎氯通道神經(jīng)毒素BmK CT與其受體的相互作用模式，對(duì)其中的功能位點(diǎn)和活性表面的重要?dú)埢M(jìn)行鑒定，從而解釋其抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤遷