BAG-1沉默對OGD-R誘導人神經母細胞瘤細胞凋亡及HSP70表達的影響.pdf

1、目的：
　　探討慢病毒介導的RNA干擾技術（RNA interference,RNAi）下調BCL-2結合抗凋亡基因（BCL-2 associated anthanogen-1,BAG-1）表達對氧糖剝奪/再復氧誘導人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）凋亡及熱休克蛋白70（Heat Shock Protein70,HSP70）表達的影響。
　　方法：
　　構建靶向BAG-1 RNAi慢病毒載體，感染對數(shù)生長期的SH-S

2、Y5Y細胞，抑制BAG-1表達。采用熒光顯微鏡觀察熒光，嘌呤霉素篩選細胞，保證感染效率>75%。轉染成功后細胞分組如下：正常細胞組（未感染慢病毒的正常SH-SY5Y細胞）；慢病毒對照組[感染含增強綠色熒光蛋白（EGFP）基因的慢病毒]；BAG-1 RNAi組（即BAG-1基因沉默組，感染含BAG-1基因干擾序列及EGFP的慢病毒），根據所用序列不同分為BAG-1 RNAi-α組、BAG-1 RNAi-β組。慢病毒感染后72 h采用蛋白質

3、免疫印跡實驗（Western Blot）檢測BAG-1 RNAi組細胞BAG-1蛋白表達情況，確定干擾效果。4組細胞分別給予氧糖剝奪4 h，8 h，12 h，24 h并復氧24 h處理，采用細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8）檢測不同氧糖剝奪條件下各組細胞活性，確定最佳氧糖剝奪時間模擬神經細胞缺血再灌注損傷，并比較各組間細胞活性的差異。采用流式細胞儀檢測氧糖剝奪8 h再復氧24 h各組細胞凋亡情況；Western Blot及實時熒

4、光定量反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測HSP70蛋白表達及mRNA轉錄水平。多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗用于兩兩比較。結果
　　1.慢病毒感染及BAG-1基因沉默效果：感染后72 h熒光顯微鏡明暗場對比顯示慢病毒對照組、BAG-1 RNAi-α組、BAG-1 RNAi-β組3組細胞慢病毒感染效率均在75%以上；Western Blot結果顯示，BAG-1RNAi-β組BAG-1干擾效果優(yōu)于BAG

5、-1 RNAi-α組。
　　2.BAG-1基因沉默降低氧糖剝奪/再復氧損傷SH-SY5Y細胞活性：CCK-8結果顯示，各組細胞活性隨缺氧時間延長，先增強后減弱，且于8h達峰值，因此采用氧糖剝奪8 h，再復氧24 h的SH-SY5Y細胞作為神經細胞缺血再灌注損傷細胞模型。經缺氧8 h再復氧24 h處理后，BAG-1 RNAi-β組吸光度（A值）顯著低于正常細胞組、慢病毒對照組及BAG-1 RNAi-α組（A值：0.591±0.091

6、比0.937±0.118，0.902±0.106，0.910±0.139，均P＜0.01）。
　　3.BAG-1基因沉默導致氧糖剝奪/再復氧損傷 SH-SY5Y細胞凋亡增加：BAG-1 RNAi-β組細胞凋亡率明顯高于正常細胞組、慢病毒對照組及BAG-1 RNAi-α組[凋亡率（%）：34.633±3.464比14.833±3.753，19.933±6.490，16.400±1.179，均P＜0.01]。
　　4.BAG-1

7、基因沉默對HSP70蛋白表達及mRNA轉錄水平的影響：正常細胞組、慢病毒對照組、BAG-1 RNAi-α組與 BAG-1 RNAi-β組細胞的 HSP70蛋白表達及mRNA轉錄水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。4組細胞HSP70蛋白表達（灰度值）依次為：1.440±0.105，1.325±0.169，1.355±0.232，1.430±0.117。mRNA轉錄水平（2-△△Ct）：0.996±0.060，0.956±0.155，

8、1.047±0.154，1.002±0.178。
　　結論：
　　1.不同氧糖剝奪時間對細胞活性影響不同，氧糖剝奪8 h，再復氧24 h的SH-SY5Y細胞可作為神經細胞缺血再灌注損傷模型。
　　2.BAG-1可能對氧糖剝奪/再復氧損傷SH-SY5Y細胞具有一定的保護作用。
　　3.BAG-1基因有效沉默后，HSP70表達水平沒有變化，為進一步探討B(tài)AG-1/HSP70相互作用在缺血性腦血管疾病的研究提供一定的實