胃癌相關(guān)環(huán)狀RNA的鑒定及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、研究目的：
　　胃癌(gastric cancer，GC)是人類最為常見的惡性腫瘤之一，目前我國的胃癌死亡率仍呈上升趨勢，其主要原因還是在于早期胃癌發(fā)現(xiàn)率較低，而胃癌治療的早與晚，效果卻是非常不一樣的。早期胃癌術(shù)后5年生存率可高達90％～95％，但是如果一旦發(fā)展到了晚期，那么其死亡率就會很高了。因此，我們?nèi)粼谖赴┰缙谀苷业椒€(wěn)定的、有效的、理想的胃癌分子診斷標(biāo)志物，那對早期胃癌的診斷是至關(guān)重要的，也許可能效降低胃癌的死亡率。

2、　　環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)作為一類新穎的非編碼RNA。與之前我們研究較多的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)相比，它具有在血漿和胃液中更加穩(wěn)定存在這一顯著特點，從而使其成為早期胃癌分子診斷標(biāo)志物的理想選擇更加具有優(yōu)勢。但是由于對 circRNA的研究才剛剛起步，目前，針對circRNA在人類疾病尤其是在腫瘤中生物學(xué)功能的研究

3、更是少之又少。因此，本研究擬對胃癌相關(guān) circRNA進行篩選鑒定后，研究其在臨床診斷中的價值，尋找最佳早期胃癌分子診斷標(biāo)志物，及其對細胞周期、凋亡、增殖、遷移等生物學(xué)功能的體外研究以及通過建立裸鼠胃癌移植瘤實驗對它們的體內(nèi)研究。
　　研究方法：
　　1.結(jié)合circRNA數(shù)據(jù)庫，篩選胃癌相關(guān)circRNA。
　　2.應(yīng)用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription-p

4、olymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)對101對癌旁組織和配對的胃癌組織中 circRNA002059和circRNA001013的表達水平進行檢測，同時結(jié)合患者的臨床病理資料，分析它們在臨床診斷中的價值，篩選有效的分子診斷標(biāo)志物。
　　3.從細胞水平重點鑒定胃癌相關(guān) circRNA001013的表達水平，同時應(yīng)用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)對circ

5、RNA001013在體外細胞水平進行干擾后，研究其生物學(xué)功能。
　　4.運用實時細胞分析儀(real-time cellular analysis，RTCA)和流式細胞術(shù)分別檢測下調(diào)circRNA001013后對細胞增殖能力、細胞周期和凋亡的影響；運用劃痕實驗檢測下調(diào)circRNA001013后對細胞遷移能力的影響；運用Western blot實驗檢測下調(diào)circRNA001013后相關(guān)蛋白質(zhì)表達水平的變化。
　　5.建立裸

6、鼠胃癌移植瘤模型，從體內(nèi)水平觀察下調(diào) circRNA001013后腫瘤大小的變化，HE染色研究腫瘤形態(tài)學(xué)的改變，運用Western blot實驗和免疫組化檢測分析蛋白質(zhì)表達水平的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1. qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，胃癌相關(guān)circRNA002059和circRNA001013在胃癌組織中均為低表達，在臨床診斷中也具有一定的診斷價值，circRNA002059與性別（P=0.002）、年齡（P=0.0

7、22）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.03）和TNM分期（P=0.042）存在著一定的關(guān)系，而 circRNA0010103則與性別（P=0.001）、轉(zhuǎn)移（0.046）和 TNM分期（0.024）存在著一定的關(guān)系，且兩者均能作為胃癌分子診斷標(biāo)志物。circRNA001013在胃癌細胞株（MGC-803、SGC-7901、HGC-27、BGC-823和 AGS）的表達相比于正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)均為低表達，其結(jié)果與組織結(jié)果相一致。

8、　　2. RTCA細胞增殖實驗結(jié)果顯示，細胞增殖能力經(jīng)下調(diào) circRNA001013后有所降低(P<0.01)；細胞凋亡和周期實驗結(jié)果經(jīng)流式細胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，下調(diào) circRNA001013后沒有發(fā)現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，而細胞周期卻被阻滯在G0/ G1期，；細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，下調(diào)circRNA001013后細胞遷移能力降低(P<0.05)；Western Blot細胞實驗結(jié)果顯示，下調(diào)circRNA001013后細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2

9、(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、MMP-9、細胞周期素依賴的蛋白激酶-6(cyclin-dependent kinase-6，CDK6)、細胞周期素 D1(cyclin D1)蛋白質(zhì)表達水平明顯降低(P<0.01)。
　　3.裸鼠胃癌移植瘤實驗結(jié)果顯示，下調(diào)circRNA001013后腫瘤生長速度減慢，腫瘤體積變??；HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤形態(tài)發(fā)生改變；Western Blot和免疫組化結(jié)果均顯示，下

10、調(diào)circRNA001013后細胞周期蛋白 CDK6和 cyclinD1，轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白 MMP-2、MMP-9、血管內(nèi)質(zhì)生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和增殖相關(guān)蛋白核相關(guān)抗原(nucleus related antigen，Ki67)表達水平降低，而上皮-鈣黏蛋白(E-cadherin)蛋白水平增加，且呈一定的劑量效應(yīng)。
　　研究結(jié)論：
　　1.胃癌相關(guān)circRN

11、A002059和circRNA001013在胃癌組織中均為低表達。在臨床診斷中具有一定的診斷價值，能作為臨床分子診斷標(biāo)志物。
　　2.體外細胞水平實驗顯示，下調(diào)circRNA001013后可有效降低細胞的增殖能力；阻止細胞從 G0/ G1過渡到 S期；能有效抑制癌細胞的遷移能力；降低細胞內(nèi) cyclin D1、CDK6、MMP-2和MMP-9等細胞周期和轉(zhuǎn)移蛋白的表達。
　　3.體內(nèi)裸鼠胃癌移植瘤實驗說明，下調(diào)circRNA