基于MC-Tryptase-PAR-2-Rho-FLS信號途徑探討資木瓜總苷抗RA的作用機制.pdf

1、目的：研究資木瓜總苷抑制肥大細胞（Mast cell,MC）活化，促進成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)凋亡，減輕滑膜炎性增生及關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）作用機制。
　　方法：分離小鼠骨髓細胞誘導(dǎo)分化成骨髓源性肥大細胞mBMMCs，流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD117和 FcεRIα雙陽性表達，甲苯胺藍染色進行鑒定，電鏡觀察細胞顯微

2、結(jié)構(gòu)；CCK-8和MTT法檢測不同濃度資木瓜總苷對肥大細胞的毒性；β-己糖胺酶（β-hexosaminidase）法檢測mBMMCs活化脫顆粒情況, ELISA法檢測細胞上清中類胰蛋白酶（Tryptase）含量；分離小鼠關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細胞培養(yǎng)鑒定，流式細胞術(shù)檢測FLS細胞膜受體PAR-2的表達，流式細胞術(shù)、Western blot法檢測FLS細胞的凋亡情況；Pull-down法檢測FLS細胞中活化的Rho-GTP酶水平， Wester

3、n blot法分析活化的Rho-GTP酶中Rho蛋白水平。
　　結(jié)果：（1）資木瓜總苷可顯著降低經(jīng)DNP-BSA，A23187，和SCF體外刺激RBL-2H3和mBMMC肥大細胞β-hexosaminidase的釋放率（ P<0.01）；資木瓜總苷可顯著抑制mBMMC類胰蛋白酶的釋放(P<0.01)；而且資木瓜總苷抑制肥大細胞表面FcεRIα的表達和胞內(nèi)蛋白Lyn與 PLCγ1的磷酸化。（2）外源性的類胰蛋白酶（Tryptase）

4、顯著提高成纖維樣滑膜細胞表面PAR-2的表達，顯著活化Rho激酶（P<0.05），從而顯著抑制CH11誘導(dǎo)的成纖維樣滑膜細胞凋亡(P<0.05)；而資木瓜總苷對成纖維樣滑膜細胞無直接作用。（3）資木瓜總苷處理后的mBMMC上清可降低成纖維樣滑膜細胞表面的PAR-2受體的表達，進而抑制活化的Rho表達，顯著促進Fas介導(dǎo)的成纖維樣滑膜細胞的凋亡(P<0.05)；（4）肥大細胞與成纖維樣滑膜細胞共培養(yǎng)體系中，資木瓜總苷處理后，可顯著抑制活化

5、的Rho表達（ P<0.05），顯著促進Fas介導(dǎo)的成纖維樣滑膜細胞凋亡(P<0.05)，而加入PAR-2阻斷劑后這種作用顯著減弱。
　　結(jié)論：（1）資木瓜總苷可顯著抑制經(jīng)抗原刺激的肥大細胞活化脫顆粒；資木瓜總苷抑制肥大細胞的活化機制可能會通過FcεRIα-Lyn-PLCγ1通路實現(xiàn)。（2）肥大細胞來源的類胰蛋白酶可作用于成纖維樣滑膜細胞表面PAR-2受體進而活化Rho激酶，抑制Fas介導(dǎo)的成纖維樣滑膜細胞凋亡；（3）資木瓜總苷可