雷公藤多苷治療RA的抗血管生成作用及機理研究.pdf

1、研究目的
　　 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病?；ぱ壮志梅磸?fù)發(fā)作,可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞,關(guān)節(jié)功能障礙,甚至殘廢。本病呈全球性分布,患病率約為1％。我國的患病率約為0.32％~0.36％,是造成我國勞動力喪失和致殘的主要疾病之一。
　　 RA的主要病理改變是滑膜炎,具有類腫瘤樣生長的特點,表現(xiàn)為滑膜組織的肥厚增生,血管翳形成,對關(guān)節(jié)周

2、圍的組織產(chǎn)生侵蝕和破壞。RA的發(fā)病機制至今仍未完全闡明,人們逐漸認(rèn)識到血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)可能是RA的發(fā)病機制中具有重要作用的細胞因子,并對其展開了深入研究。目前除抗炎及對癥治療外還沒有特效的治療方法。隨著人們對血管生成與RA的了解,抗血管生成治療成為新的研究熱點。雷公藤多苷(Tripterygiumglucosides)是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)作用的中藥制劑,對RA

3、有一定療效。雷公藤作為目前治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中療效最被肯定的單味中藥,主要有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗菌、抗生育等作用,對于前兩個作用的研究比較深入,但抗血管生成作用機制以及相關(guān)動物實驗研究較少。
　　 本研究通過觀察雷公藤多苷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體2(VEGFR2)表達水平的影響,研究雷公藤多苷治療RA中的抗血管生成作用,并闡明其可能作用機制,為

4、臨床合理應(yīng)用雷公藤多苷治療RA病人提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法
　　 1、設(shè)計VEGF和VEGFR2的引物和探針,建立檢測VEGF和VEGFR2mRNA的實時熒光定量PCR方法,優(yōu)化實驗條件,并評估其特異性、重復(fù)性。
　　 2、建立CIA大鼠模型,造模成功后用雷公藤多苷干預(yù),并以沙利度胺作為陽性對照。
　　 3、利用建立的實時熒光定量PCR法檢測雷公藤多苷對CIA模型大鼠VEGF和VEGFR2基因表達的

5、影響,并用ELISA方法檢測大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量。
　　 4、對VEGF基因在健康大鼠組織(肺、心、肝臟、腎臟、腦、胃、腸和頜下腺)特異性表達進行分析。
　　 5、對RA患者滑膜組織進行細胞培養(yǎng),細胞培養(yǎng)成功后用雷公藤多苷進行干預(yù),觀察分析VEGF和VEGFR2的表達情況。
　　 結(jié)果
　　 1、經(jīng)DNA測序和電泳分析,檢測VEGF和VEGFR2的擴增分析是特異的,定量分析其相關(guān)系數(shù)均＞0

6、.98,大鼠VEGF和VEGFR2mRNA檢測的重復(fù)性好,其批內(nèi)變異系數(shù)(CV)分別為2.0％~6.7％和2.0％~6.4％,批間變異系數(shù)(CV)分別為3.5％~10.6％和3.6％~10.2％。
　　 2、模型組大鼠關(guān)節(jié)評分和腫脹度與正常組相比有明顯差異(P＜0.01),其滑膜組織病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜被覆細胞變性、增生,滑膜間質(zhì)有炎細胞浸潤,并有肉芽組織形成,關(guān)節(jié)軟骨有不同程度的損傷,進而纖維組織增生、關(guān)節(jié)局部纖維化,嚴(yán)重時導(dǎo)致

7、關(guān)節(jié)腔消失。關(guān)節(jié)周圍皮下軟組織內(nèi)見“Ⅱ型膠原”引起的遲發(fā)性交態(tài)反應(yīng),局部有多量的類上皮細胞增生呈結(jié)節(jié)狀,并有淋巴細胞浸潤。
　　 3、雷公藤多苷組、沙利度胺組大鼠各組織中VEGF和VEGFR2mRNA均低于模型對照組(P＜0.05),與沙利度胺組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4、健康大鼠肺組織中VEGFmRNA表達最高,與其他任意組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),其它各組織間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　

8、5、模型組大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量顯著高于正常對照組(P＜0.05),雷公藤多苷組、沙利度胺組大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量低于模型對照組(P＜0.05)。
　　 6、雷公藤多苷干預(yù)RA患者滑膜細胞后,VEGF和VEGFR2mRNA的水平明顯下降((P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 本研究成功建立了準(zhǔn)確定量分析VEGF和VEGFR2mRNA的實時熒光定量PCR方法;通過動物試驗和細胞培養(yǎng)試驗研

9、究,結(jié)果表明,雷公藤多苷治療RA具有療效,其作用機制可能與通過降低VEGF和VEGFR2表達水平,有效抑制血管生成有關(guān)。
　　 本實驗研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在:(1)近年來對VEGF的研究較多,但對其基因表達的研究常采用分子雜交和常規(guī)RT-PCR等半定量的方法,其定量的準(zhǔn)確性不足,變異也比較大,進而對研究結(jié)論的可靠性有一定的影響。本研究建立的檢測大鼠組織中VEGF和VEGFR2mRNA的實時熒光定量PCR方法,首次將絕對定量與相對定量

10、結(jié)合,其定量分析的準(zhǔn)確度和靈敏度均遠高于以前的方法。(2)對健康大鼠不同部位組織VEGF特異性表達進行了檢測分析,為以后研究在疾病大鼠模型中表達水平奠定了基礎(chǔ),國內(nèi)外尚未見報道。(3)首次應(yīng)用實時熒光定量PCR的方法進行VEGFR2mRNA的檢測。(4)雷公藤作為目前治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中療效最被肯定的單味中藥,其抗炎、免疫抑制作用的研究比較深入,但抗血管生成作用機制以及相關(guān)動物實驗研究較少,本研究通過動物實驗、細胞培養(yǎng)試驗,比較系統(tǒng)地