Bex4在小鼠睪丸Sertoli細(xì)胞中的表達(dá)定位及功能研究.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　Bex基因（brain expressed X-linked gene family)屬于X染色體連鎖基因家族，其家族成員與腦的高級功能和退行性疾病關(guān)系密切。Bex4，又名BexL1、Tceal7，是Bex成員之一。據(jù)文獻(xiàn)報道，Bex4在心臟、骨骼肌、肝臟、腎臟均有表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Bex4在雄性睪丸中有表達(dá)，因此本研究擬探索Bex4在小鼠睪丸組織的表達(dá)定位，檢測其在生精功能受損模型中的表達(dá)改變，并通過建

2、立Bex4過表達(dá)Sertoli細(xì)胞株，以探究Bex4在雄性生殖功能中所發(fā)揮的作用。
　　實驗方法：
　　1.免疫組化、免疫熒光方法檢測Bex4蛋白的表達(dá)定位。
　　2.構(gòu)建氯化鎘(Cadmium chloride,CdCl2)干擾模型
　　體內(nèi)實驗：本實驗選用C57小鼠,設(shè)對照組和CdCl2處理組，5天后處死小鼠，取出睪丸組織，HE染色觀察睪丸組織的形態(tài)變化， Western blotting檢測Bex4蛋白在生

3、精功能受損小鼠睪丸組織中表達(dá)水平。
　　體外實驗：5、10μM CdCl2處理 Sertoli細(xì)胞24h，48h后， Western blotting技術(shù)檢測Bex4蛋白在睪丸Sertoli細(xì)胞中表達(dá)水平的變化。
　　3.制備Bex4過表達(dá)慢病毒，轉(zhuǎn)染小鼠睪丸Sertoli細(xì)胞，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，Western blotting檢測Bex4過表達(dá)后蛋白表達(dá)水平；MTT細(xì)胞活性實驗檢測Bex4過表達(dá)后對Sertoli細(xì)胞增殖動力

4、學(xué)的影響；流式細(xì)胞儀檢測Bex4過表達(dá)后，Sertoli細(xì)胞周期改變情況；Real-time PCR技術(shù)檢測Bex4對Sertoli細(xì)胞功能標(biāo)志基因表達(dá)水平影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.免疫組化、免疫熒光實驗結(jié)果顯示 Bex4在小鼠睪丸組織中Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞及精細(xì)胞均表達(dá)；在睪丸Sertoli細(xì)胞中定位于胞漿。
　　2. CdCl2干擾小鼠后，Western blotting實驗結(jié)果表明Bex4蛋

5、白表達(dá)水平在CdCl2誘導(dǎo)的生精功能受損過程中上調(diào)；進(jìn)一步的體外實驗證實Bex4在CdCl2處理的Sertoli細(xì)胞中上升，Western blotting結(jié)果顯示CdCl2通過激活p38信號通路上調(diào)Bex4表達(dá)。
　　3.建立Bex4上調(diào)TM4 Sertoli細(xì)胞株，MTT結(jié)果顯示Bex4上調(diào)抑制細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明 Bex4干擾細(xì)胞周期，阻滯發(fā)生在G1期；Real-time PCR分析表明Bex4上調(diào)后不影響Serto

6、li細(xì)胞功能標(biāo)志基因AMH、Tf、FSHR、claudin-11與ZO-1的mRNA表達(dá)水平，但明顯下調(diào) DHH、 Rhox5、ABP、 Inhibin和 clusterin的 mRNA表達(dá)水平。
　　實驗結(jié)論：
　　Bex4在小鼠睪丸組織Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞及精細(xì)胞均有表達(dá),亞細(xì)胞定位顯示 Bex4表達(dá)于 Sertoli細(xì)胞的胞漿；CdCl2刺激可以導(dǎo)致睪丸中Bex4表達(dá)明顯上調(diào)，體外實驗證明CdCl2通過