經血源性子宮內膜干細胞的生物學特性及多向分化潛能的實驗研究.pdf

1、目的:現(xiàn)階段，用于研究干細胞的主要材料來源于胚胎干細胞和骨髓間充質干細胞，但這兩種來源的干細胞都存在著部分的局限性，例如涉及創(chuàng)傷性、倫理道德性等，所以現(xiàn)臨床急需要尋找一種新型的干細胞以避免上述干細胞標本倫理學的爭議、來源的缺乏及腫瘤形成的潛在性等弊端。本實驗主要研究來源于經血的經血源性子宮內膜干細胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells。MenSCs)在體外獲取及培養(yǎng)增殖的方法并鑒

2、定，觀察細胞的形態(tài)及生長情況等基本生物學特性以及體外誘導其向成骨細胞成脂細胞方向分化以及重點實驗體外誘導其向子宮內膜上皮和間質細胞方向分化的可行性及不同濃度雌激素對分化結果的影響。為其在臨床中的應用奠定一定基礎。
　　方法:本實驗采用Ficoll密度梯度法從月經第二天健康女性經血中分離MenSCs,采用經典的MTT法對體外擴增的第一代、第二代細胞描繪生長曲線，并通過傳代培養(yǎng)、體外擴增,使用倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及在培養(yǎng)過程中

3、的動態(tài)增殖變化。第二代細胞經流式細胞儀檢測免疫表型的表達情況。取第二代 MenSCs,分成誘導組和對照組。分別按5×104/mL接種至明膠包被的6孔板中,24小時細胞貼壁后。誘導組培養(yǎng)液更換成干細胞成骨誘導分化基礎培養(yǎng)基+專用血清,成骨誘導液為：雙抗、200μmol/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和0.1μmol/L地塞米松。對照組培養(yǎng)液換為L-DMEM添加10％FBS,細胞置入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每兩

4、天換液1次,連續(xù)培養(yǎng)3周。分別在第1、2、3周結束誘導結束時，通過檢測ALP活性、膠原表達情況、以及鈣結節(jié)表達情況，觀察成骨誘導的效果；分組方法同上，取第2代MenSCs,按5×104/mL接種于被明膠包被的6孔板中,細胞過夜貼壁后誘導組更換為干細胞成脂誘導分化基礎培養(yǎng)基+專用血清,1×10-6mol/L地塞米松,10mol/L胰島素,0.5mmol/L IBMX,0.2mmol/L吲哚美辛,對照組培養(yǎng)液L-DMEM添加10% FBS,

5、細胞置入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每兩天換液1次。分別在誘導2、3、4周結束時,進行油紅O染色，鏡下觀察油紅染色的結果。通過檢測MenSCs成骨成脂的誘導情況。探討其在體外向成骨成脂方向分化的潛能。將培養(yǎng)后的MenSCs分為4個研究組，每組培養(yǎng)體系中添加生長因子(TGF-β10ng/ml。EGF10ng/ml。PDGF-BB10ng/ml)和不同濃度17-β-雌二醇(1×10-9 mol/L、1×10-8 mol/L、1

6、×10-7 mol/L、1×10-6mol/L),分別標記為組1、組2、組3、組4，培養(yǎng)體系中未添加生長因子和雌激素的組為對照組。誘導培養(yǎng)5天后觀察細胞形態(tài)學變化及應用免疫細胞化學法檢測人子宮內膜上皮細胞標記物角蛋白（cytokeratin，CK）和基質細胞標記物波形蛋白（Vimentin，VIM），同時運用RT-PCR和Westernblot檢測CK、VIM mRNA表達水平及蛋白表達的量，以進一步驗證MenSCs是否向子宮內膜方向分

7、化及不同雌激素濃度對分化過程的影響。
　　結果:本實驗表明利用 Ficoll離心法能從健康女性月經血中分離并培養(yǎng)出干細胞，此原代細胞約1.5周達到85%~90%融合，細胞多成梭形、漩渦狀、輻射狀。MTT法得出細胞倍增時間約為30~32h。此細胞傳代后能穩(wěn)定生長，可見細胞形態(tài)以纖維樣為主導。發(fā)現(xiàn)傳代中，在接種細胞1~2天，細胞增殖緩慢，第3~4天全量換液后細胞生長迅速，進入對數(shù)生長期，接著5-6天后細胞生長較前緩慢，進入平臺期，整個

8、過程未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。用流式細胞儀術檢測結果顯示，此類細胞表面標記OCT-4、Strol-1、CD45、表達率分別為95.13%±0.81%，1.80%±0.92%，0.93%±0.42%。細胞表現(xiàn)出OCT-4強陽性，Strol-1、CD45陰性。此說明培養(yǎng)的細胞具有胚胎干細胞性質。誘導分化實驗表明MenSCs成骨誘導前期誘導組細胞膠原表達量較后期升高,MenSCs誘導兩周后經茜素紅染色可見鈣結節(jié)明顯,誘導組細胞ALP(alkaline

9、phosphatase)活性-成骨細胞分化成熟的重要標志隨著誘導時間延長呈上升趨勢，強陽性，對照組陰性。經成脂誘導3周,有明顯的脂滴出現(xiàn)，油紅O染色呈陽性，對照組陰性。體外向子宮內膜細胞方向分化結果表明：各研究組 CK、VIM mRNA表達水平及蛋白表達量明顯高于對照組（p<0.05)；組2（1×10-8mol/L）CK mRNA表達水平最高與其他4組相比較(p<0.05，)，且CK mRNA表達量隨雌激素濃度增高略有下降；而VIM的m

10、RNA表達量相反，即隨著雌激素濃度增高 VIM mRNA表達的量增加，但差異無統(tǒng)計學意義。CK和 VIM蛋白相對表達量也顯示這一結果。證實MenSCs在體外細胞生長因子和雌激素刺激下能夠向子宮內膜細胞方向分化，且雌激素濃度不同分化結果有差異。
　　結論:通過Ficoll密度梯度離心法能獲得MenSCs，流式細胞術檢測特定的細胞表面標志物也證實了其為經血源性子宮內膜干細胞，進一步的實驗也表明其能在體外誘導向成骨細胞和脂肪細胞方向分化