桑葉防治糖尿病的效應(yīng)成分群及其作用機制研究.pdf

1、第一章、文獻研究
　　第一節(jié)較系統(tǒng)地總結(jié)和歸納了國內(nèi)外關(guān)于糖尿病發(fā)病機制、診斷方法和治療方案等研究方面取得的進展，以期為糖尿病的深入認識以及臨床治療提供科學(xué)參考。
　　第二節(jié)采用計算機對中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫中關(guān)于治療消渴癥的方劑進行檢索，應(yīng)用Excel2010軟件建立方劑數(shù)據(jù)庫，收錄每首組方中的單味藥從而進行統(tǒng)計分析。采用關(guān)聯(lián)規(guī)則方法對組方中藥對以及藥組的應(yīng)用特點進行分析，從而探討治療消渴經(jīng)方的用藥規(guī)律與特點。
　　第三節(jié)通

2、過歸納與分析近年來國內(nèi)外學(xué)者在糖尿病發(fā)病機制的認識、桑葉對其調(diào)節(jié)血糖的功效成分及其作用機制等方面取得的研究進展，以期為桑葉調(diào)控血糖及防治糖尿病并發(fā)癥的作用機制深入研究提供指引，為桑葉資源的開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。
　　第二章、桑葉多組分提取物的制備研究
　　第一節(jié)干燥桑葉稱重后，采用回流提取的方法，其工藝參數(shù)為:料液比1∶40，溶劑為70％乙醇，提取時間45min，提取2次，兩次提取液過濾合并，減壓濃縮至無醇味。選擇AB-8

3、型號的大孔樹脂對粗提物進行純化。桑葉提取物以2BV·h-1的流速上樣，采用70％的乙醇以3mL·min-1的流速進行洗脫，收集洗脫液，濃縮并冷凍干燥，進樣分析。黃酮類成分含量為0.1％，酚酸類成分含量為0.4％，純化后其含量分別為5.3％、10.8％。
　　第二節(jié)干燥桑葉稱重后，采用料液比1∶12，回流1h的提取方法進行提取，提取液采用80％醇沉24h，上清液濃縮后在陽離子交換樹脂上樣，采用0.5mol· L-1的氨水以1.5mL

4、·min-1的流速進行洗脫，分別收集pH7-9.4，pH9.4-10.5，pH10.5-13的不同pH段的洗脫液，濃縮，冷凍干燥得純化的生物堿組分。DNJ主要集中在pH7-9.4和pH9.4-10.5兩段，含量分別達到19.9％和39.4％。
　　第三節(jié)干燥桑葉采用水提醇沉的方法對多糖類成分進行提取，得到桑葉粗多糖提取物。利用Sevage和AB-8大孔樹脂純化多糖，上柱溶液pH=8，用0.1mg·mL-1的NaCl濃度以2mL·m

5、in-1的洗脫速度進行洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥，得純化的桑葉多糖組分。其中多糖含量由0.69％提高為18.9％。
　　第三章、采用葡萄糖氧化酶法，以蔗糖為底物，采用α-葡萄糖苷酶抑制模型對桑葉多組分進行評價;采用等效線法、周-特氏聯(lián)合指數(shù)法和等輻射分析法評價兩組分間的藥效相互作用及量效特點，為揭示桑葉降血糖的作用機理提供科學(xué)依據(jù)?；钚栽u價表明，桑葉黃酮、生物堿、多糖組分均具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其抑制率隨各組分濃度的增

6、加而升高，3個組分中桑葉生物堿抑制活性最強。桑葉生物堿與桑葉黃酮配伍、桑葉生物堿與桑葉多糖配伍均表現(xiàn)出協(xié)同增效作用，但桑葉多糖與桑葉黃酮組配伍未見明顯的協(xié)同作用。
　　第四章、采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對桑葉治療糖尿病的8種活性成分的分子作用機制進行分析，揭示其多成分-多靶點-多通路的作用特點及相關(guān)關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)分析表明，桑葉中8種活性成分共涉及47個靶點，63條通路。這些通路與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等相關(guān)，其中包括與糖尿病關(guān)聯(lián)的胰島素、MAPK

7、、VEGF、Wnt、Jak-STAT等多條信號通路。
　　第五章、采用雄性SD大鼠灌胃桑葉生物堿、黃酮提取物，在不同時間點采集血漿樣品，處理后進行檢測。結(jié)果表明，槲皮素和山柰酚灌胃0.333 h后達到峰值，說明大鼠口服桑葉黃酮組分后吸收和分布迅速。服藥后4h左右，兩者第二次達到峰濃度，說明其在腸道內(nèi)的停留時間較長，可能原因為體內(nèi)存在肝腸循環(huán)。DNJ和Fagomine在胃腸道能較快地吸收入血，血藥濃度在0.667 h達到峰值，說明兩

8、者進入大鼠體循環(huán)后快速分布，發(fā)揮藥效迅速。
　　第六章、采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計學(xué)分析，利用代謝組學(xué)的研究方法和技術(shù)探討糖尿病模型小鼠血漿和尿液的整體代謝物譜特征、代謝輪廓變化和生物標志物群，并對桑葉生物堿、黃酮、多糖提取物干預(yù)后的生物效應(yīng)轉(zhuǎn)歸與分子機制進行研究。結(jié)果表明，5組小鼠的血漿和尿液代謝物譜都得到了很好的區(qū)分，發(fā)現(xiàn)并鑒定了血漿中17個以及尿液中21個潛在生物標

9、志物，血漿中生物標志物主要與纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸降解、色氨酸代謝和甘油磷脂代謝相關(guān)，尿液中生物標志物主要與苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、煙堿和煙酸鹽代謝、組氨酸代謝和鞘脂類代謝通路相關(guān)。這些代謝通路在糖尿病小鼠體內(nèi)發(fā)生紊亂，而給予桑葉黃酮、多糖、生物堿組分后可使之逆轉(zhuǎn)并向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸。
　　第七章、
　　第一節(jié)采用腸道L細胞株GLUTag細胞為研究對象，研究AGEs對其細胞損傷、凋亡及炎癥損傷的影響，在

10、此基礎(chǔ)上研究桑葉生物堿類、黃酮類、多糖類提取物以及單體DNJ和異槲皮苷干預(yù)后相應(yīng)指標的變化，從而探討其調(diào)節(jié)糖尿病的分子機制。結(jié)果顯示，AGEs與RAGE結(jié)合后，可通過激活caspase-3、-9、誘導(dǎo)p53/Bax通路誘導(dǎo)腸道L細胞發(fā)生凋亡，同時激活NF-κB因子表達，釋放TNF-α、IL-1、IL-6，從而使腸道L細胞產(chǎn)生炎癥損傷。給予桑葉多組分后，各指標均向正常組回調(diào)，從而改善腸道L細胞炎癥損傷，阻止細胞凋亡。
　　第二節(jié)采用

11、HepG2細胞為研究對象，優(yōu)化胰島素的作用濃度和作用時間，最終建立HepG2胰島素抵抗細胞模型的最佳造模方法，在此基礎(chǔ)上觀察桑葉多組分對造模后的HepG2細胞葡萄糖吸收的影響。結(jié)果表明，胰島素以3μg·mL-1作用48 h誘發(fā)的胰島素抵抗效果最佳。桑葉生物堿、黃酮、多糖三個提取物和DNJ、異槲皮苷單體可以明顯增加胰島素抵抗細胞的葡萄糖消耗，桑葉生物堿、黃酮、多糖三個提取物和DNJ、異槲皮苷單體處理后再用胰島素造模與造模同時給藥的HepG

12、2細胞，葡萄糖吸收與正常水平?jīng)]有顯著差異，提示桑葉多組分可在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮作用。
　　第三節(jié)采用前脂肪細胞株3T3-L1為研究對象，觀察高糖誘導(dǎo)后對細胞分化、葡萄糖攝取、脂肪細胞因子mRNA的表達的影響，在此基礎(chǔ)上研究桑葉生物堿類、黃酮類、多糖類提取物以及單體DNJ和異槲皮苷干預(yù)后相應(yīng)指標的變化，從而探討其調(diào)節(jié)糖尿病糖脂代謝的分子機制。結(jié)果顯示，桑葉生物堿、黃酮、多糖組分及DNJ、異槲皮苷單體在低濃度時可促進3T3-L1

13、前脂肪細胞的增殖，同時均可促進脂肪細胞分化關(guān)鍵因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1的表達，從而促進脂肪細胞的分化和葡萄糖攝取、轉(zhuǎn)運，提高脂肪細胞胰島素敏感性，繼而改善胰島素抵抗。
　　第四節(jié)采用腎小管上皮細胞株HK-2為研究對象，觀察高糖誘導(dǎo)后對其ROS、NADPH氧化酶、ERK1/2水平的影響，在此基礎(chǔ)上研究桑葉生物堿類、黃酮類、多糖類提取物以及單體DNJ和異槲皮苷干預(yù)后相應(yīng)指標的變化，從而探討其調(diào)節(jié)糖尿病腎病的分子機制