基于分子對(duì)接的熟地防治糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的有效成分和作用機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是糖尿病并發(fā)單位體積內(nèi)骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)改變，骨強(qiáng)度減低、脆性增加等易發(fā)生骨折的一種全身性、代謝性骨骼疾病，是糖尿病在骨骼系統(tǒng)的重要并發(fā)癥之一。糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷或胰島素功能障礙引起的以高血糖為特征的代謝疾病。持續(xù)的高血糖和長(zhǎng)期的代謝紊亂引起各器官的損傷，特別是對(duì)于眼睛、腎、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)，是導(dǎo)致DOP的原因。作為糖尿病患者的主要骨并發(fā)癥，由于其發(fā)病

2、隱形、發(fā)病率和致殘風(fēng)險(xiǎn)高的特征，已越來(lái)越受到人們的關(guān)注。
　　熟地黃是玄參科多年生植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)的干燥塊根，具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓的功效，作為傳統(tǒng)中藥已有兩千多年的歷史。大量臨床和藥理實(shí)驗(yàn)表明熟地黃可抗腫瘤、抗應(yīng)激、抗凝血、降低血糖、減少骨丟失，提示具有防治DOP潛力。本課題以熟地黃作為研究對(duì)象，應(yīng)用高糖高脂飼料結(jié)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠模型明確了熟地黃抗DOP作用

3、;利用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)熟地黃抗DOP的活性成分及作用靶點(diǎn);采用高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷模型，根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果研究活性成分對(duì)高糖損傷成骨細(xì)胞的作用機(jī)制。本課題研究了熟地黃防治糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠的作用，明確了熟地黃中抗DOP的活性成分及其作用機(jī)制。據(jù)此開(kāi)展了以下方面研究工作:
　　一、熟地黃抗DOP藥效研究
　　采用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素注射誘導(dǎo)糖尿病性骨質(zhì)疏松模型，對(duì)熟地黃抗DOP作用進(jìn)行了藥效學(xué)研究，觀察了熟地黃水

4、提液對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠血糖、血清和尿液生化指標(biāo)，骨組織形態(tài)和計(jì)量參數(shù)的影響。結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血糖顯著升高，ROI區(qū)域骨質(zhì)較為疏松，骨小梁數(shù)目顯著減少，且骨小梁間隙顯著增大，造模成功。模型組大鼠的骨形成指標(biāo)堿性磷酸酶活性、骨鈣素水平和骨吸收指標(biāo)抗酒石酸酸性磷酸酶活性和DPD含量均顯著升高，提示糖尿病性骨質(zhì)疏松可能是高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥。熟地黃及熟地黃與二甲雙胍連用顯著提高血清中堿性磷酸酶活性，顯著降低了血清骨鈣素和尿液

5、DPD含量，但對(duì)血液中抗酒石酸酸性磷酸酶含量無(wú)顯著影響。此外，陽(yáng)性藥二甲雙胍組、熟地黃組及熟地黃聯(lián)合二甲雙胍用藥組可顯著增加模型大鼠股骨骨密度、骨組織礦含量、骨體積分?jǐn)?shù)，同時(shí)顯著減少骨小梁分離度，表明熟地黃可促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，具有抗糖尿病性骨質(zhì)疏松作用，熟地黃聯(lián)合二甲雙胍用藥效果更為明顯。
　　二、基于分子對(duì)接策略篩選熟地黃防治DOP的活性成分和作用靶點(diǎn)
　　構(gòu)建糖尿病性骨質(zhì)疏松關(guān)鍵靶蛋白庫(kù)(BMP2、Carbonic

6、 anhydrasesⅡ、CathepsinK、β-catenin、ERK5、GSK-3β、IGF-1R、JNK、PPAR-γ)和熟地黃化學(xué)成分庫(kù)，利用分子對(duì)接技術(shù)將熟地黃化學(xué)成分與DOP關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行對(duì)接分析，結(jié)果顯示共有44個(gè)成分與9個(gè)蛋白對(duì)接成功，其中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)（18個(gè)）和苯乙醇苷類(lèi)成分(11個(gè))能量值較低，具有較好的結(jié)合活性，而在這9個(gè)蛋白中與熟地黃成分結(jié)合較好的為GSK-3β、IGF-1R及PPAR-γ。利用western

7、blot法對(duì)環(huán)烯醚萜類(lèi)成分中的梓醇、苯乙醇苷類(lèi)中的毛蕊花糖苷和松果菊苷與GSK-3β、IGF-1R、PPAR-γ的結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證，Western blot結(jié)果顯示熟地黃活性成分給藥4h后，梓醇給藥組、毛蕊花糖苷給藥組和松果菊苷給藥組中成骨細(xì)胞的IGF-1R表達(dá)量升高，PPAR-γ和GSK-3β表達(dá)減少。
　　三、熟地黃活性成分對(duì)高糖損傷成骨細(xì)胞的作用機(jī)制探討
　　采用高糖誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞損傷模型考察了熟地黃中環(huán)烯醚

8、萜苷類(lèi)和苯乙醇苷類(lèi)共6個(gè)成分的體外抗糖尿病性骨質(zhì)疏松及機(jī)制研究。結(jié)果顯示熟地黃環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分梓醇和苯乙醇苷類(lèi)成分毛蕊花糖苷能夠增加BMP2、RUNX2和Osteriex的表達(dá)，進(jìn)而增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性和骨基質(zhì)的礦化。同時(shí)能夠刺激成骨細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，增加胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體的表達(dá)，增加PI3K的磷酸化和mTOR的表達(dá)，最終促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和分化。熟地黃環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分梓醇和苯乙醇苷類(lèi)成分毛蕊花糖苷還可抑制GSK