轉(zhuǎn)lgtC基因甜菜糖分分析和轉(zhuǎn)乳糖合成酶基因甜菜的獲得.pdf

1、Globotriose是一種具有重要價(jià)值的寡糖。在大腸桿菌中，在外源添加乳糖情況下，它的合成需要3個(gè)關(guān)鍵酶基因：（1）susA，編碼Sucrose synthase（EC2．4．1．13）；（2）galE，編碼UDP-galactose4-epimerase（EC5．1．3．2）；（3）ιgtC，編碼α-1，4-galactosyltransferase（EC2．4．1．x）。在植物中，Globotriose因缺少ιgtC酶和乳糖而不能

2、被合成。 ιgtC基因，來(lái)自奈瑟氏腦膜炎球菌（Neisseria meningitidis），該酶催化從UDP-Gal上轉(zhuǎn)移一個(gè)半乳糖殘基到乳糖末端上。本工作以轉(zhuǎn)ιgtC基因的甜菜植株為材料，研究甜菜細(xì)胞糖組分的變化，探求ιgtC基因?qū)D(zhuǎn)基因植株代謝和生長(zhǎng)發(fā)育的影響。 為了準(zhǔn)確測(cè)定轉(zhuǎn)基因甜菜的可溶性總糖組成和含量，本工作利用薄層層析方法分離和鑒定轉(zhuǎn)基因植株的各種糖分，同時(shí)采用高效液相色譜分離和示差折光檢測(cè)器測(cè)定技術(shù)定量葉

3、片提取液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量，采用反向高效液相色譜分離和光電二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定UDP-半乳糖的含量。 人的乳糖合成酶由二亞基組成，其調(diào)節(jié)亞基為乳清蛋白（α-lactalbumin），由LALBA基因編碼；催化亞基為β-1，4-galactosyltransferase（EC2．4．1．22），由Gal-T1基因編碼，催化從UDP-Gal上轉(zhuǎn)移一個(gè)半乳糖殘基到葡萄糖末端上合成乳糖。本工作擬以轉(zhuǎn)ιgtC基因的甜菜叢生芽為受體

4、將LALBA、Gal-T1基因轉(zhuǎn)入甜菜，探討利用轉(zhuǎn)基因甜菜合成乳糖、Globotriose的可行性。 1.轉(zhuǎn)ιgtC基因甜菜糖分的分析 首先用RT-PCR方法篩選出ιgtC基因高效表達(dá)的甜菜轉(zhuǎn)基因株系，然后對(duì)這些株系進(jìn)行可溶性總糖、單糖和二糖以及核苷糖測(cè)定分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)正義基因的株系無(wú)論葉中還是塊根中的可溶性總糖含量均較野生型株系顯著提高，相應(yīng)的葡萄糖、果糖和蔗糖含量與野生型株系相比也均有不同程度的提高；轉(zhuǎn)基因株系UD

5、P-半乳糖含量與對(duì)照相比顯著降低；而轉(zhuǎn)反義基因株系的可溶性總糖、UDP-糖以及其它糖分含量均與野生型植株無(wú)明顯差異。 轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育觀察和光合作用測(cè)定表明，向甜菜中轉(zhuǎn)入來(lái)源于原核生物的ιgtC基因未影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育和光合作用。 2.轉(zhuǎn)乳糖合成酶基因甜菜的獲得 從人的cDNA文庫(kù)（Marathon-Ready cDNA）中克隆得到乳糖合成酶基因（LALBA基因、Gal-T1基因），構(gòu)建雙基因串聯(lián)的植物表達(dá)載體

6、并轉(zhuǎn)化已有的轉(zhuǎn)ιgtC基因甜菜叢生芽，獲得聚合三個(gè)基因的甜菜植株。 建立起四個(gè)轉(zhuǎn)，ιgtC正義基因株系的離體叢生芽體系，經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)株系L1、L2、L3、L4與WT都有叢生芽發(fā)生，誘導(dǎo)時(shí)間相差不大，其中株系L2不定芽的發(fā)生時(shí)間較早。培養(yǎng)6周后，不同株系的誘導(dǎo)率均大于86％。隨著叢生芽塊繼代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同株系間出現(xiàn)差異。有的株系的單芽在繼代培養(yǎng)過(guò)程中增殖迅速，發(fā)生次生芽較多，而有些株系的單芽生長(zhǎng)雖快但較少發(fā)生次生芽

7、。 選取ιgtC基因表達(dá)活性較高且次生芽增殖迅速的株系L2、L4的叢生芽，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將乳糖合成酶基因引入甜菜，經(jīng)PCR檢測(cè)獲得了聚合三個(gè)基因（LALBA、Gal-T1、ιgtC）的甜菜植株。 本論文以ιgtC基因和從人cDNA文庫(kù)中分離的乳糖合成酶基因?yàn)槟繕?biāo)基因，利用甜菜細(xì)胞為受體，獲得了轉(zhuǎn)入單個(gè)或數(shù)個(gè)目標(biāo)基因的植株，同時(shí)研究了轉(zhuǎn)基因植株中糖代謝途徑的改變對(duì)糖分積累、生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為探測(cè)甜菜細(xì)胞糖代謝途徑調(diào)控機(jī)制