NOTCH3及其CADASIL突變體的相關功能比較研究.pdf

1、背景:伴皮質下梗死及白質腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈血管病變(CADASIL)是由Notch3基因突變引起的遺傳性血管性癡呆疾病。CADASIL的典型病理特點是血管壁中血管平滑肌細胞顯著的進行性退化直至消失，并伴有Notch3胞外區(qū)及致密顆粒性嗜鋨物質(GOM)堆積。遺傳連鎖分析已證實位于第19號染色體上的Notch3基因的突變是導致該病的原因，目前認為這是一種功能獲得性突變，但是基因突變導致其具體獲得何種新的功能及其相關機制目前尚不

2、清楚。本實驗就其可能獲得的新功能和相關機制在多種細胞系中進行篩選和探討。
　　方法:本實驗在人胸主動脈平滑肌細胞(HAVSMC)、人肺成纖維細胞(IMR-90)、鼠小膠質細胞(BV2)、人宮頸癌細胞(HeLa)、人乳腺癌細胞（MCF-7和HCC1937）上進行相關研究。首先我們用重組PCR的方法構建Notch3的CADASIL突變體R90C和R169C的真核表達載體，然后用脂質體（Lipofectamine2000）轉染的方法將野

3、生型(WT) Notch3及突變體R90C和R169C轉染到以上細胞中。用蛋白免疫印跡(Western blot)方法研究胞外基質蛋白collagen和fibronectin及DNA甲基轉移酶1(DNMT1)的表達情況;用RT-PCR的方法檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平的變化情況，用Griess法檢測NO水平的變化情況;分別用劃線法和細胞計數(shù)法檢測腫瘤細胞遷移和增殖情況。所有數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學分析，P＜0.05具有

4、統(tǒng)計學意義。
　　結果:首先，用重組PCR的方法，我們成功構建Notch3的CADASIL突變體R90C和R169C的真核表達載體;然后將突變體轉染到HAVSMC細胞中，發(fā)現(xiàn)胞外基質蛋白collagen和fibronectin的表達有明顯上升，這與CADASIL的病理特征是相符合的，但在IMR-90細胞中胞外基質蛋白collagen和fibronectin的表達有明顯下降;在BV2細胞中，我們發(fā)現(xiàn)突變體可以降低炎癥因子NO水平，但

5、對TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平?jīng)]有影響;在HeLa細胞中我們發(fā)現(xiàn)細胞的遷移和增殖都有明顯的上升，但在MCF-7和HCC1937細胞中卻得出了與HeLa細胞相反的結果;在HeLa和IMR-90細胞中，突變體可以抑制DNMT1的表達，而野生型Notch3卻無此調控作用。
　　結論:1、CADASIL突變體和野生型Notch3對細胞外基質蛋白collagen和fibronectin的表達，在HAVSMC和IMR-90細胞中有

6、不同的調控作用;2、CADASIL突變體和野生型Notch3均可影響B(tài)V2細胞NO的釋放水平;3、CADASIL突變體和野生型Notch3對腫瘤細胞遷移和增殖有不同的調控作用，且這種差異調控與腫瘤細胞種類有關。4、CADASIL突變體可以抑制HeLa和IMR-90細胞DNMT1的表達，而野生型Notch3卻無此調控作用。
　　總的來說，我們發(fā)現(xiàn)Notch3突變體在不同的細胞系中呈現(xiàn)出不同的調控作用，提示Notch3突變體可能具有較