酵母Pub1-RRM2和RPA14的克隆、表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)分析.pdf

1、一、Pub1-RRM2蛋白的克隆、表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)分析基因的表達(dá)在真核生物中是一個(gè)受高度調(diào)控的過程，主要包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。mRNA的翻轉(zhuǎn)(mRNAturnover)，主要通過定位于mRNA上的順式作用元件與作為反式作用因子的RNA結(jié)合蛋白之間的相互作用來介導(dǎo)的，它在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控中發(fā)揮著極其重要的作用。RNA結(jié)合蛋白是真核生物中普遍存在的一種蛋白，能特異性地與RNA或DNA結(jié)合，調(diào)控生物體代謝的多個(gè)過程，發(fā)揮

2、著非常重要的作用。RNA結(jié)合蛋白通常含有多種不同的結(jié)構(gòu)域，而RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域(RNArecognitionmotif，RRM)則是其中一個(gè)非常普遍的結(jié)構(gòu)域，它能夠與特定的RNA或DNA序列結(jié)合來調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性，并能參與蛋白-蛋白之間的相互作用，是真核生物中一種非常重要的結(jié)構(gòu)域。 Poly(U)結(jié)合蛋白1[Poly(U)bindingprotein1，Pub1]是酵母細(xì)胞中的一個(gè)非常重要的Poly(A)RNA結(jié)合蛋白，它在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)

3、胞核中都有分布，并且其量在核與質(zhì)中的分布沒有差別。Pub1除結(jié)合poly(A)之外，還與poly(U)和poly(G)有很強(qiáng)的結(jié)合能力和結(jié)合特異性，故此命名。Pub1作為反式作用因子，主要通過與含有AU序列(AU-richelements，AREs)和穩(wěn)定元件(stabilizerelements，STEs)的mRNA結(jié)合來調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，在mRNA的翻轉(zhuǎn)調(diào)控中發(fā)揮著很重要的作用。此外研究還發(fā)現(xiàn)，Pub1除調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性之外

4、，還可能調(diào)控其代謝的其它方面，如翻譯或轉(zhuǎn)運(yùn)。Pub1含有三個(gè)RRMs，每個(gè)RRM都含有保守序列RNP1和RNP2，它們?cè)诮Y(jié)合含AREs和STEs的mRNA中發(fā)揮著重要的作用，能阻止此類mRNA的降解。但三個(gè)RRM的功能可能各不相同，而其中的第二個(gè)RRM可能特異性地結(jié)合Poly(U)，并且決定整個(gè)Pub1蛋白的結(jié)合特異性。 我們從酵母基因文庫中克隆了Pub1的第二個(gè)RRM序列，并構(gòu)建了RRM2-pET22b質(zhì)粒。重組蛋白R(shí)RM-H

5、isTag在E.coliRosetta(DE3)中有很高的表達(dá)量，經(jīng)過Ni親和柱純化和分子篩分離之后，蛋白的純度達(dá)到95％以上，凝膠液相層析分析表明蛋白在溶液中以單體形式存在，且SDS-PAGE顯示蛋白沒有明顯降解。用懸滴氣相擴(kuò)散法經(jīng)過初篩和進(jìn)一步優(yōu)化后得到RRM的晶體，X-Ray衍射分辨率達(dá)到1.69A并進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)的收集。數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示晶體所屬空間群為H3，晶胞參數(shù)為a=b=73.11A，c=41.12A。分析計(jì)算和自旋patte

6、rson函數(shù)計(jì)算均表明，一個(gè)晶體學(xué)不對(duì)稱單位中只含有一個(gè)蛋白質(zhì)分子。以人源TIA-1的第二個(gè)RRM為結(jié)構(gòu)模型，用分子置換方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。 二、RPA14蛋白的克隆、表達(dá)及純化真核生物中有三種不同的RNA聚合酶，即RNA聚合酶Ⅰ，RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ。酵母細(xì)胞中的RNA聚合酶Ⅰ由14個(gè)亞基組成，核心部分含有10個(gè)亞基，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄特殊的rDNA時(shí)還需4個(gè)特殊的亞基，即：RPA49，RPA43，RPA34.5，RPA14

7、。其中的RPA14和RPA43在體內(nèi)易形成異二聚體，具有較高的保守性，它能與rDNA特異性的轉(zhuǎn)錄因子Rrn3p相互作用，召募RNA聚合酶Ⅰ結(jié)合到rDNA的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；同時(shí)RPA14/RPA43還能結(jié)合ssRNA。RPA14缺失試驗(yàn)使核心酶失去轉(zhuǎn)錄活性，說明RPA14在RNA聚合酶Ⅰ中起到非常重要的作用，且RPA14能穩(wěn)定RPA43與核心酶之間的相互作用。 從酵母基因文庫中克隆了RPA14的CDS序列，并構(gòu)建了pET22b