DPY-30-like C端結(jié)構(gòu)域與Musashi1 RRM1的晶體學(xué)研究.pdf

1、生物大分子的結(jié)構(gòu)解析一直以來都是生命科研一個(gè)重要研究領(lǐng)域。一方面通過對(duì)生物大分子單體結(jié)構(gòu)的解析可以獲得這些大分子的三維結(jié)構(gòu)，了解其重要的功能區(qū)域，從而闡釋生物大分子在生物體中發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；另一方面通過對(duì)相互作用的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與核酸等復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析，清楚地揭示生物大分子之間相互作用的方式和作用機(jī)理。此外，生物大分子的功能研究對(duì)結(jié)構(gòu)分析起到重要的指導(dǎo)作用，如果沒有深入透徹的功能研究，對(duì)大分子的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的分析也僅是理論上的推

2、測(cè)，缺乏實(shí)際的實(shí)驗(yàn)支持。因此，結(jié)構(gòu)解析和功能研究是相互依賴相輔相成的。為了更詳盡理解結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，我們制備了DPY-30-likeC端結(jié)構(gòu)域和MusashiRRM1結(jié)構(gòu)域的晶體并解析了它們的三維結(jié)構(gòu)。
　　 人源DPY-30-like是線蟲劑量補(bǔ)償效應(yīng)復(fù)合物的重要成員--DPY-30的同源蛋白。劑量補(bǔ)償效應(yīng)是生物體在進(jìn)化過程為了應(yīng)對(duì)由性染色體差異而可能造成的危害的一種機(jī)制，線蟲雌性個(gè)體(XX型)通過降低X連鎖基因的表達(dá)而使得

3、X連鎖基因的表達(dá)與雄性的表達(dá)水平相當(dāng)。此外，DPY-30-like及其同源蛋白廣泛存在于包括酵母、線史、果蠅和人的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中，并與ASH2L及其同源蛋白相互作用。通過構(gòu)建DPY-30-likeC端55個(gè)氨基酸的原核表達(dá)載體、表達(dá)、純化及一系列結(jié)晶條件的摸索，最終得到了高分辨率的母體和硒代蛋白晶體，采用單波長(zhǎng)反常散射法(SAD)解析了DPY-30-likeC端結(jié)構(gòu)。對(duì)DPY-30-likeC端結(jié)構(gòu)域解析發(fā)現(xiàn)其是兩個(gè)單體緊密包

4、裹的二聚體。分析超離和分子篩的結(jié)果同時(shí)證明DPY-30-likeC端結(jié)構(gòu)域在溶液狀態(tài)下的分子量約為14.2kDa，與二聚體的分子量接近，說明其存在狀態(tài)為二聚體形式。每個(gè)DPY-30-likeC端結(jié)構(gòu)域單體是由2條α螺旋和中間的一段柔性區(qū)組成的，兩個(gè)單體反向排列形成類似X形狀的二聚體。參與二聚體形成的主要作用力為疏水相互作用和位于蛋白兩端的氫鍵作用力。二聚體表面形成一個(gè)明顯的較寬區(qū)域的疏水面，這與PKA的調(diào)節(jié)亞基的N端Rllα具有相似的蛋

5、白表面的電荷性質(zhì)，提示此類蛋白與其它蛋白相互作用區(qū)域具有相似的理化性質(zhì)。疏水表面也可能是DPY-30-like結(jié)合ASH2L的區(qū)域。
　　 另一個(gè)解析的蛋白質(zhì)為Musaslu1，它是一類在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，廣泛分布在神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞和某些特定的腫瘤細(xì)胞中，通過結(jié)合numb的特征序列抑制它的翻譯，激活Notch信號(hào)通路，促使細(xì)胞增殖。采用與DPY-30-IikeC端相似的表達(dá)純化手段，通過篩查不同的晶體生長(zhǎng)

6、條件最終得到分辨率為1.8A的晶體，數(shù)據(jù)收集之后采用分子置換的方法解析了MusashilRRM1的結(jié)構(gòu)。MusashilRRM1具有典型的RRM結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，形成β1α1β2β3α2β4的結(jié)構(gòu)特征，其β1β3形成的疏水面含有保守殘基Phe8、Phe48、Phe50，這三個(gè)氨基酸的突變會(huì)導(dǎo)致MusashilRRM1結(jié)合RNA的能力完全喪失。說明該疏水面對(duì)于保持RNA結(jié)合能力的重要性。
　　 通過對(duì)DPY-30-likeC端結(jié)構(gòu)域和