脾虛證兒童sAA活性比值和甜味覺差異小鼠糖代謝研究.pdf

1、目的:
　　本文研究脾虛證兒童檸檬酸刺激前后sAA活性比值變化，以及AMY1拷貝數(shù)、sAA蛋白含量、N-糖基化和非糖基化sAA含量改變，旨在為脾虛證兒童采用酸刺激前后sAA活性比值作為臨床診斷參考指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)，并探討sAA活性比值下降與AMY1表達(dá)及sAA的N-糖基化修飾是否有關(guān)聯(lián)。
　　本文選用甜味受體基因差異小鼠進(jìn)行甜味覺刺激實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠機(jī)體糖代謝反應(yīng)情況，初步探討從甜味覺受體角度研究脾虛證的可能性。
　　方

2、法:
　　1、本研究2013年3月至11月，以廣告形式從廣州市海珠區(qū)婦幼保健院和廣東藥學(xué)院校園分別募集47名健康兒童和52名健康成人，采集唾液標(biāo)本后-80℃保存，并在一星期內(nèi)以碘化鉀法提取基因組DNA。DNA提取后，DNA含量和純度測(cè)定以及體外PCR擴(kuò)增驗(yàn)證如上述;另外，為了探討唾液中微生物和食物殘?jiān)欠駮?huì)干擾PCR擴(kuò)增，本研究還對(duì)碘化鉀法提取的基于因組DNA進(jìn)行了TP53基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。在上述收集的全部脾虛證和健康對(duì)

3、照兒童病例中，經(jīng)過測(cè)量身高(cm)和體重(kg)后，根據(jù)6個(gè)大型國際流行病學(xué)調(diào)查界定的標(biāo)準(zhǔn)，以體重指數(shù)將其分為低BMI和正常BMI兒童;另外，根據(jù)中國肥胖工作組設(shè)立的標(biāo)準(zhǔn)排除超重或肥胖兒童。
　　采取唾液及指標(biāo)測(cè)定
　　唾液流率、pH值及總蛋白測(cè)定:唾液流率即為唾液體積與收集耗時(shí)的比值; pH精密試紙測(cè)定唾液pH值;BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定唾液總蛋白含量(mg/mL)。
　　sAA活性測(cè)定:利用國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)

4、聯(lián)盟所推薦的EPS-G7速率法，來測(cè)定sAA活性(U/mL)。sAA比活(U/mg)=sAA活性(U/mL)/總蛋白含量(mg/mL)。
　　sAA含量測(cè)定:通過引進(jìn)已知含量的人源sAA標(biāo)準(zhǔn)品，利用WB的方法測(cè)定檸檬酸刺激前后唾液樣品中糖基化、非糖基化及總sAA的含量(mg/mL)。sAA糖基化水平即糖基化sAA含量占總sAA含量的比例。
　　AMY1基因拷貝數(shù)測(cè)定:根據(jù)本實(shí)驗(yàn)前述從唾液中提取基因組DNA方法學(xué)考察結(jié)果，利用

5、碘化鉀法提取兒童唾液基因組DNA后，對(duì)AMY1基因和腫瘤蛋白TP53基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
　　采用GraphPad Prism5.0進(jìn)行作圖并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(X)±SD表示，刺激前后唾液指標(biāo)組內(nèi)比較進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.小鼠甜味覺差異與代謝及食欲等生理與行為學(xué)指標(biāo)相關(guān)性研究
　　2.1 動(dòng)物倫理

6、、模型及分組
　　小鼠是利用129P3/J(129)和C57BL/6ByJ(B6)小鼠雜交后產(chǎn)生F1代，接著F1雜合后代F2再與129回交超過10次培育而成。經(jīng)TaqMan的SNP基因座鑒定分析方法鑒定，該系小鼠含兩種基因型，分別是129/B6-Tas1r3雜合小鼠(簡寫:B6/129)和129/129-Tas1r3純合小鼠(簡寫:129/129)。以129/129純合小鼠為對(duì)照組，以含外源性基因的B6/129雜合小鼠為實(shí)驗(yàn)組，兩

7、組小鼠數(shù)量在12只到29只不等。
　　2.2 糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)
　　甜味覺差異會(huì)引起糖代謝的變化，本實(shí)驗(yàn)可以考察兩組小鼠糖代謝情況。當(dāng)小鼠2-mo大時(shí)，每只小鼠首先接受腹腔注射的糖耐量實(shí)驗(yàn)，接著是灌胃注射糖耐量實(shí)驗(yàn)，然后是胰島素耐量實(shí)驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)間隔一周左右以洗脫實(shí)驗(yàn)間相互影響;當(dāng)小鼠6-mo大時(shí)，進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。
　　2.3 甜味覺差異可以引起食欲變化，本實(shí)驗(yàn)可以分析兩組小鼠多個(gè)生理與行為學(xué)指標(biāo)。分別在2-mo和

8、6-mo對(duì)小鼠進(jìn)行核磁共振分析后約一周，利用LabMaster系統(tǒng)對(duì)小鼠的能量代謝、活動(dòng)量、進(jìn)食及飲水量等進(jìn)行測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，數(shù)據(jù)進(jìn)行平均化處理，得到24小時(shí)的平均數(shù)據(jù)進(jìn)行展示。
　　2.4 體重曲線和身體成分構(gòu)成分析實(shí)驗(yàn)
　　體重曲線:小鼠體重分別在2-mo、3-mo、4-mo、5-mo和6-mo時(shí)于上午10:00左右進(jìn)行測(cè)量，精確到0.1g，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后繪制體重曲線。
　　利用LunarPIXImusⅡdensit

9、ometer的雙能X線吸收測(cè)量法對(duì)小鼠身體成分進(jìn)行分析;解剖:對(duì)小鼠進(jìn)行DEXA后，解剖脂肪組織和內(nèi)臟器官并稱重。
　　2.5 統(tǒng)計(jì)分析
　　采用Statistica統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度和面積檸檬酸刺激對(duì)健康成人唾液分泌的影響
　　研究結(jié)果提示，0.2M/2×或0.4M/1×檸檬酸濾紙可以顯著增加成人唾液的分泌和sAA活性，且刺激后sAA活性比值明顯高于刺激時(shí)。
　　

10、2.不同保存條件和提取方法對(duì)從唾液中提取基因組DNA的影響
　　2.1 碘化鉀法與試劑盒法提取新鮮和室溫保存唾液DNA的比較
　　2.1.1 基因組DNA的得率和純度
　　研究結(jié)果提示，碘化鉀法對(duì)兩種不同保存條件下唾液DNA的得率比較穩(wěn)定，但可能也存在少量RNA和鹽離子、糖類物質(zhì)的殘留。
　　2.1.2 基因組DNA電泳結(jié)果
　　結(jié)果提示碘化鉀法對(duì)提取兩種不同保存條件下唾液DNA的降解程度較輕。
　　

11、2.1.3 基因組DNA體外PCR擴(kuò)增
　　兩種不同提取方法和保存條件下得到的DNA樣品對(duì)TP53(192bp)和PRB-3(1261bp)基因都有非常好的PCR擴(kuò)增效果，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。
　　2.2 碘化鉀法提取-80℃凍存唾液DNA考察
　　研究結(jié)果提示，相對(duì)于商業(yè)試劑盒法，碘化鉀法可以快速穩(wěn)定地從不同保存條件下的唾液中提取足量和高質(zhì)量的DNA。
　　3.脾虛證兒童酸刺激前后唾液指標(biāo)變化
　　

12、研究提示健康兒童唾液分泌對(duì)檸檬酸刺激反應(yīng)良好。提示脾虛證兒童酸負(fù)荷下唾液分泌反應(yīng)減弱。兩組兒童AMY1基因拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AMY1基因拷貝數(shù)對(duì)脾虛證兒童sAA活性比值改變可能無影響。
　　4.消瘦兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標(biāo)組間比較兩組兒童刺激前后sAA含量和活性均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果提示AMY1基因拷貝數(shù)對(duì)消瘦兒童sAA活性比值改變可能無影響。
　　5.甜味覺差異對(duì)小鼠糖代謝及食欲等的影響。結(jié)果

13、提示含來源于B6的Tas1r3等位基因小鼠即B6/129雜合小鼠，甜味覺病理性過高。
　　5.1 B6/129和129/129小鼠糖代謝比較。結(jié)果表明腹腔注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對(duì)受損。灌胃注射后，結(jié)果表明灌胃注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對(duì)受損。相對(duì)129/129小鼠，含外源性基因的B6/129小鼠腹腔及灌胃注射糖耐量均受損，符合脾虛證糖耐量異?；蚴軗p的特征。
　　5.2 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)注射胰島素后并

14、未發(fā)現(xiàn)顯著的基因型效應(yīng)，結(jié)果提示兩組小鼠對(duì)胰島素敏感性相似。
　　5.3 基因型效應(yīng)對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響接近顯著，結(jié)果提示，B6/129小鼠進(jìn)食和飲水量顯著降低，進(jìn)一步推測(cè)其更符合脾虛證特征。2-mo時(shí)，posthoc顯示雄性129/129小鼠在11:00、12:00、13:00、14:00和15:00五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RER均顯著高于雄性B6/129小鼠(P＜0.05);6-mo時(shí)，雌性129/129小鼠在00:00、03:00和04:

15、00三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RER均顯著高于雌性B6/129小鼠(P＜0.05)，并且，雄性129/129小鼠在14:00和15:00兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RER也顯著高于雄性B6/129小鼠(P＜0.05)?？梢?，相對(duì)于129/129小鼠，B6/129的RER顯著降低。
　　基因型效應(yīng)對(duì)小鼠的EE有顯著的影響，結(jié)果提示，B6/129的RER及EE顯著降低，能量代謝可能異常，符合脾虛證特征?；蛐托?yīng)對(duì)小鼠活動(dòng)量的影響是顯著的(P＜0.05)，相對(duì)于1

16、29/129小鼠，B6/129小鼠平均活動(dòng)量更大。
　　5.4 B6/129和129/129小鼠體重曲線和身體成分構(gòu)成比較。
　　5.4.1 體重曲線
　　本研究并未發(fā)現(xiàn)兩組小鼠體重增長有明顯差異。
　　5.4.2 身體成分構(gòu)成分析
　　核磁共振(NMR)分析:相對(duì)129/129小鼠，B6/129小鼠脂肪含量可能更高，但隨著時(shí)間推移下降相對(duì)明顯。
　　雙能X線吸收測(cè)量法(DEXA)分析:GLM分析并未

17、發(fā)現(xiàn)兩組小鼠各DEXA指標(biāo)有明顯差異，但B6/129小鼠的脂肪含量有高于129/129小鼠的趨勢(shì)。
　　解剖分析: 雖然兩組小鼠體重增長無顯著差異，但就脂肪含量來說，B6/129小鼠可能更高，特別是棕色脂肪含量，即B6/129小鼠脂代謝可能異常，亦符合脾虛證特征。
　　結(jié)論:
　　脾虛證兒童研究表明，患兒酸刺激后sAA活性比值下降，并伴有sAA糖基化水平異常升高，而AMY1基因拷貝數(shù)無顯著變化，結(jié)果提示酸刺激后sAA活

18、性比值測(cè)定可作為兒童脾虛證臨床診斷客觀參考指標(biāo)之一，而sAA活性比值下降可能與其糖基化調(diào)控機(jī)制有關(guān)。消瘦兒童獲得與脾虛證兒童研究的類似結(jié)果，提示脾虛是兒童消瘦的發(fā)病機(jī)制之一，同時(shí)也說明消瘦作為脾虛證的證候診斷指標(biāo)之一是有科學(xué)依據(jù)的。
　　小鼠實(shí)驗(yàn)研究表明，Tas1r3同源異基因的B6/129小鼠甜味覺病理性過高，類似《內(nèi)經(jīng)》“有病口甘者”，出現(xiàn)糖脂代謝異常、食欲下降及能量代謝紊亂等現(xiàn)象，提示B6/129小鼠有應(yīng)用于作為類脾虛證小鼠