阻斷PI3K-AKT-mTOR信號傳導(dǎo)通路對胃癌細胞放化療耐受影響的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤。超過70％的新發(fā)病例和死亡病例出現(xiàn)在發(fā)展中國家。胃癌治療的主要手段有手術(shù)、放療和化療。但是部分患者經(jīng)過放療、化療后仍然會出現(xiàn)局部進展和放化療耐受的情況。因此，明確胃癌治療后局部進展和放化療耐受的機制，從而增強胃癌細胞對放療和化療的敏感性，提高放化療的有效率是胃癌治療過程中亟待解決的問題。
　　本研究以胃癌細胞株BGC-823為研究對象，從以下兩個方面進一步探討胃癌放化療治療后

2、腫瘤局部進展以及放化療耐受的可能機制:1.胃癌細胞經(jīng)過化療藥物處理后的細胞干性、EMT、PI3K通路蛋白、耐藥相關(guān)酶以及對放療敏感性變化的研究；2.通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路提高放化療敏感性的機制研究。
　　第一部分胃癌細胞經(jīng)過化療藥物處理后的細胞干性、EMT、PI3K通路、化療敏感性的變化及放療耐受的可能機制
　　目的：
　　比較5-FU，L-OHP單獨或者聯(lián)合處理胃癌細胞后，腫瘤細胞干細胞標志物、EMT

3、標志物、細胞周期、藥物代謝酶以及信號傳導(dǎo)通路的變化。分析細胞出現(xiàn)化療藥物和放射線耐受的原因和可能機制。
　　方法：
　　采用CCK-8法檢測氟尿嘧啶（Fluorouracil，5-FU）,奧沙利鉑（Oxaliplati， L-OHP）作用胃癌細胞的抑制率，計算IC50,比較細胞形態(tài)學(xué)差異；采用Western blotting和RT-PCR檢測化療藥物處理細胞后CD44、Nanog、Oct4、Sox2、E-cadherin和

4、N-cadherin表達情況。Western blotting方法檢測化療藥物對胃癌細胞PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路蛋白、胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase，TS酶）、二氫嘧啶脫氫酶（Dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD酶）和ERCC1蛋白表達的影響。流式細胞技術(shù)檢測化療藥物對胃癌細胞細胞周期的影響；克隆形成實驗比較藥物處理后細胞接受不同劑量放射線照射后克隆形成能力的差異。

5、免疫組化方法分析胃癌術(shù)后患者組織標本中Nanog、Oct4、Sox2和E-cadherin蛋白表達情況。以及 Nanog、Oct4、Sox2和 E-cadherin表達水平同患者預(yù)后之間關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　未經(jīng)處理的胃癌細胞呈相互連接生長，使用化療藥物處理細胞后，細胞間連接減少，細胞變圓，失去正常形態(tài)。Western blotting和RT-PCR均提示化療藥物治療腫瘤細胞后引起干細胞標志物的表達升高，特別是5-FU+L

6、-OHP治療組升高更明顯。5-FU+L-OHP組的CD44、Nanog、Oct4和Sox2表達明顯高于單用5-FU或者L-OHP處理組。而5-FU+L-OHP組的E-cadherin表達和其他治療組以及未治療細胞相比表達明顯下調(diào)，相反 N-cadherin表達卻明顯上調(diào)。同時，化療藥物處理細胞后引起TS酶、DPD酶和ERCC1等蛋白升高，降低胃癌細胞對化療藥物的敏感性。對信號傳導(dǎo)通路蛋白分析提示，藥物處理后的細胞出現(xiàn)PI3K/AKT/m

7、TOR信號傳導(dǎo)通路蛋白p-AKT和p-mTOR、p85和p110表達的升高。特別是5-FU+L-OHP治療組通路蛋白升高更為明顯。對腫瘤細胞的細胞周期分析結(jié)果顯示，細胞經(jīng)化療藥物處理后使S期細胞亞群比例由30±0.8%升高到80±1.7%?？寺⌒纬蓪嶒灡砻髀?lián)合處理組細胞對放射線具有耐受性。對人胃癌組織術(shù)后標本的分析發(fā)現(xiàn), Nanog、 Oct4、 Sox2和 E-cadherin在標本中的表達率分別為26.1%、53.6%、49.3%和

8、60.9%。Nanog、Sox2、Oct4和E-cadherin的表達同患者的性別、年齡和分化程度無關(guān)，但是Sox2表達差異同臨床分期有關(guān)。Oct4的表達水平同淋巴結(jié)侵犯有關(guān)。E-cadherin表達水平同淋巴結(jié)侵犯及臨床分期相關(guān)。Oct4的高表達和E-cadherin低表達同患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　化療藥物處理細胞后出現(xiàn)干細胞標志物表達上調(diào)，E-cadhrein表達下調(diào)，同時藥物代謝酶升高，細胞周期阻滯在S期，

9、PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路激活，細胞對放化療出現(xiàn)耐受性。
　　第二部分PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路在胃癌放化療耐受中的作用
　　目的：
　　第一部分結(jié)果提示化療藥物處理細胞后引起細胞干性增強、EMT增強、耐藥相關(guān)酶表達升高、PI3K/AKT/mTOR信號通路激活、細胞周期S期阻滯和細胞對放化療耐受。采用 NVP-BEZ235阻滯該信號傳導(dǎo)通路，分析其對腫瘤細胞干細胞性，細胞周期，放化療耐受的影響。

10、
　　方法：
　　采用 CCK-8方法檢測 NVP-BEZ235對聯(lián)合藥物處理后細胞增殖的影響。Western blotting分析 NVP-BEZ235處理細胞后干細胞標志物以及 EMT標志物CD44、Nanog、Oct4、Sox2、E-cadherin和 N-cadherin表達情況。比較阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后對該信號傳導(dǎo)通路蛋白p85、p110、p-AKT和p-mTOR，以及TS酶、DPD酶和ERCC1等

11、的影響。流式細胞技術(shù)分析NVP-BEZ235對細胞周期的影響?？寺⌒纬蓪嶒灡容^阻斷信號傳導(dǎo)通路后細胞對放療敏感性是否恢復(fù)。
　　結(jié)果：
　　NVP-BEZ235對聯(lián)合化療藥物處理后細胞具有殺傷作用。采用其阻斷PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路后，引起干細胞標志物CD44、Nanog、Oct4和Sox2表達下調(diào)。EMT標志物E-cadherin表達上調(diào)，N-cadherin表達下調(diào)。同時通路蛋白p85、p110、p-AKT

12、和p-mTOR以及TS酶，DPD酶和ERCC1表達均下調(diào)。說明該通路阻滯后腫瘤細胞的干細胞性減弱，EMT現(xiàn)象下降，藥物耐藥酶的表達降低，細胞對化療敏感性部分恢復(fù)。細胞周期分析，使用NVP-BEZ235后 S期細胞亞群比例由80±1.7%下降到36.3±3.2%?？寺⌒问皆囼炓舱f明阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后，細胞對放療的敏感性部分恢復(fù)。
　　結(jié)論：
　　通過阻斷細胞PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路，能夠降低胃癌