成人特發(fā)性膜性腎病患者M型膦脂酶A2受體1(PLA2R1)檢測及IgA腎病患者血清IgA-C3比值標記物的篩查.pdf

1、隨著環(huán)境的改變、藥物的使用、腫瘤發(fā)病率的增加、老年患者腎活檢量增加，腎炎病理疾病譜發(fā)生了巨大變化。膜性腎病(membranous nephropathy, MN)在腎炎腎活檢中所占的比率也逐年升高，根據(jù)上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院統(tǒng)計從2000年的7.1％升至2009年的22.7％。王海燕教授研究表明，在總?cè)巳褐?，膜性腎病已經(jīng)成為繼IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)之后的第二大病理類型。在大于60歲的老年人群中，膜性腎

2、病是最常見的病理類型。在過去的半個世紀中，腎臟病學家在膜性腎病發(fā)病機制方面做了許多努力，包括成功制造Heymann's膜性腎病動物模型以及發(fā)現(xiàn)中性肽鏈內(nèi)切酶(NEP)參與兒童膜性腎病發(fā)病等。2009年，Beck等人在大約70％特發(fā)性膜性腎病患者血清中發(fā)現(xiàn)抗M-型磷脂酶A2受體(PLA2R1)抗體，提出該抗原是特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranousnephropathy, IMN)的主要靶抗原。隨后PLA2R1受到了越

3、來越多腎臟病學家的關(guān)注。我國人群基因、飲食習慣、環(huán)境均異于國外，并且關(guān)于我國IMN腎組織PLA2R1抗原的研究鮮有報道。
　　在我國，IgA腎病占原發(fā)性腎小球疾病的45％～50％，是我國人群中最常見的腎小球腎炎，同時也是世界范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球疾病。血清IgA/C3比值作為一個簡單的檢測指標，在IgA腎病診斷中價值尚未形成定論。并且關(guān)于血清IgA/C3比值與IgAN的病理間的關(guān)系研究較少。
　　目的：
　　1.檢

4、測我國IMN患者腎組織PLA2R1抗原的表達，探討其腎組織PLA2R1抗原表達與血清該抗體表達陽性率的差異。
　　2.評價血清IgA/C3比值在IgAN診斷預測中的價值及其與IgAN病理之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.成人特發(fā)性膜性腎病患者腎組織PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗體的檢測
　　1.1 研究對象
　　選取2010年5月至2014年5月于南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科行腎活檢證實的成人IM

5、N、其他腎小球疾病及繼發(fā)性膜性腎病患者共114例，包括IMN41例、乙型肝炎病毒相關(guān)性膜性腎病(HBV-MN)8例、Ⅴ型狼瘡腎炎(LN)8例、IgA腎病27例、微小病變性腎病(MCD)19例、輕度系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)5例、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)6例。IMN的診斷是根據(jù)腎活檢病理診斷為膜性腎病，經(jīng)詳細的詢問病史及相關(guān)實驗室檢查排除由系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎病毒、腫瘤等繼發(fā)性膜性腎病。本研究所納入的病例臨床上均未長期

6、使用免疫抑制劑或（和）糖皮質(zhì)激素治療，所有腎活檢均經(jīng)患者知情同意。
　　1.2 標本采集及方法
　　B超聲引導下行腎活檢穿刺，常規(guī)行光鏡、免疫熒光和電鏡檢測。采用直接免疫熒光法對新鮮冰凍組織常規(guī)進行IgA、IgM、IgG、C3、C4、C1q染色。對石蠟組織行HE染色、PAS染色、PASM染色、MASSON染色。我們使用石蠟包埋組織組織采用間接免疫熒光法，檢測IMN、繼發(fā)性膜性腎病及其他腎小球疾病腎組織PLA2R1抗原。

7、>　　收集血清標本:留取腎活檢當日清晨空腹靜脈血，所有標本均采血5ml，置于促凝劑試管中，凝固后使用離心機離心8min，轉(zhuǎn)速為3000r/min，分離血清，凍存于-80℃冰箱待檢。檢測IMN患者血清抗PLA2R1抗體。
　　1.21 腎組織PLA2R1抗原的檢測
　　材料:兔抗人PLA2R1多克隆抗體(Sigma，HPA012657)，F(xiàn)ITC標記抗兔IgG二抗(CW0114)，BSA固體粉末（Sigma公司）。
　　

8、石蠟切片:經(jīng)烤片;脫蠟;1∶20蛋白酶K消化30min; PBS沖洗;5％BSA室溫下封閉（勿沖洗）;加一抗（兔抗人PLA2R1多克隆抗體），37℃孵育1.5小時;PBS沖洗3次，甩干后加二抗（鼠抗兔IgG CWIBO）;孵育1小時左右，PBS沖洗3次，封片;-20℃避光保存。熒光顯微鏡下觀察，奧林巴斯激光掃描共聚焦顯微鏡下拍攝。
　　根據(jù)熒光強度劃分為陰性、±、+、++、+++、++++。
　　陰性對照:對每種疾病均使用P

9、BS替代一抗做對照，只有加PBS陰性并且加一抗陽性者，才判斷為陽性。
　　1.22 間接免疫熒光法檢測IMN患者血清抗PLA2R1抗體
　　遵照歐盟檢測試劑盒Phospholipase A2 receptor1(PLA2R1) IgG(FA1254-1005-50 IgG)試劑說明書進行樣本稀釋、加樣、溫育、沖洗、加熒光二抗、溫育、沖洗、封片、熒光顯微鏡（激發(fā)光:488nm）下觀看（詳細步驟見第一章材料及方法）。
　　

10、1.3 收集臨床資料
　　收集患者腎活檢時年齡、性別、實驗室檢查（包括血肌酐、血清白蛋白、24小時尿蛋白定量）。根據(jù)患者腎臟組織光鏡及電鏡病理結(jié)果，對41例IMN進行病理分期（Ⅰ-Ⅴ期）。
　　2.血清中IgA/C3比值在IgA腎病診斷預測中的價值及其與IgA腎病臨床及病理聯(lián)系
　　2.1 研究對象
　　收集南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院2009年12月至2015年2月腎活檢診斷為 IgA腎病患者66例，其他腎小球疾病

11、患者111例（其中特發(fā)性膜性腎病40例，微小病變性腎病33例，非lgA沉積的系膜增生27例和局灶節(jié)段性腎小球硬化癥11例）和健康對照者40例。并且排除下列:(1)腫瘤、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜等繼發(fā)性IgA腎病;(2)光鏡下腎小球數(shù)目較少（小于8個腎小球）;(3)腎活檢時eGFR＜10 ml/min/1.73 m2。IgA腎病診斷根據(jù)免疫熒光結(jié)果，在腎小球系膜區(qū)以IgA和補體C3沉積為主，伴或者不伴IgG和IgM沉積。本

12、研究所納入病例均未長期使用免疫抑制劑或（和）糖皮質(zhì)激素治療。健康對照組參與者尿常規(guī)檢查均未見尿蛋白，均無高血壓、糖尿病、慢性腎炎等病史。
　　2.2 臨床指標
　　我們收集患者腎活檢時年齡、性別、收縮壓、舒張壓、血尿酸、血肌酐、血紅蛋白(Hb)、血清白蛋白(Alb)、血尿素氮(BUN)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、24小時尿蛋白定量。eGFR使用MDRD公式計算，e

13、GFR=[175×(Scr)-1.234×(Age)-0.179×(iffemale，0.79)]。血清IgA、補體C3使用CRM470調(diào)整后的標準化免疫比濁法檢測。
　　2.3 病理分級
　　所有腎活檢穿刺標本均行光鏡、免疫熒光和電鏡檢查。對IgA腎病進行病理分級（包括Lee氏及牛津分級）。腎活檢病理的診斷及分級經(jīng)兩位病理醫(yī)生獨立診斷，有爭議的診斷經(jīng)所有作者參與病理討論后決定。
　　結(jié)果：
　　1.成人特發(fā)性膜

14、性腎病患者腎組織PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗體的檢測
　　1.1 根據(jù)病理類型比較患者的一般資料
　　IMN組、繼發(fā)性膜性腎病組及其他腎炎組患者在年齡、性別、24小時尿蛋白定量、血清白蛋白、血肌酐間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明病理類型不同對腎臟的損傷程度有影響，并且腎臟病不同病理類型的發(fā)病年齡及性別也不一致。
　　1.2 IMN腎組織PLA2R1抗原陽性與患者陰性一般資料對比
　　IMN患者P

15、LA2R1抗原陽性者與患者PLA2R1抗原陰性者在年齡、性別、血清白蛋白、血肌酐及24小時尿蛋白定量之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　1.3 IMN及繼發(fā)性膜性腎病腎組織PLA2R1抗原的陽性率
　　在41例特發(fā)性膜性腎病中，35例患者腎組織發(fā)現(xiàn)PLA2R1抗原的沉積;PLA2R1沿腎小球毛細血管袢呈細顆粒狀沉積。其中6例特發(fā)性膜性腎病患者腎組織中并未發(fā)現(xiàn)PLA2R1抗原的沉積。
　　在繼發(fā)性膜性腎?。á跣屠?/p>

16、瘡腎炎及乙型肝炎病毒相關(guān)性膜性腎病）和其他腎炎對照組患者腎組織中均未發(fā)現(xiàn)PLA2R1抗原的沉積。
　　1.4 IMN患者腎組織PLA2R1抗原與血清抗PLA2R1抗體陽性率比較
　　在41例IMN患者血清中，30例抗PLA2R1抗體陽性（陽性率為73.17％）。腎組織及血清均發(fā)現(xiàn)PLA2R1者27例，有8例腎組織PLA2R1抗原陽性但血清抗PLA2R1抗體陰性，3例腎組織PLA2R1抗原陰性血清抗PLA2R1抗體陽性，3例兩

17、者均陰性。兩種檢測方法之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.276)。
　　結(jié)論：
　　1.在成人IMN患者腎組織中PLA2R1抗原陽性率為85.37％，血清抗PLA2R1抗體陽性率73.17％。腎組織PLA2R1抗原與血清抗PLA2R1抗體陽性率差異無統(tǒng)計學意義。并且腎組織PLA2R1抗原陽性與抗原陰性患者在臨床表現(xiàn)上無統(tǒng)計學差異。
　　2.IgA腎病患者血清IgA/C3比值較其他腎小球疾病組和健康對照組明顯升高。血清IgA