AMPK-AP-2α-IkBα通路抗AS的作用和機制以及相關藥物干預研究.pdf

1、AS是一種有基因突變、環(huán)境刺激、代謝異常等多種因素相互作用的多因素疾病。AS的病因以及機制復雜不明，目前研究顯示吸煙、高齡、高血壓、男性性別、高膽固醇血癥和糖尿病是導致AS的主要危險因素。臨床上急性冠狀動脈綜合征如果合并糖尿病30天和1年的死亡率顯著高于無糖尿病患者。糖尿病與心血管事件遠遠不是血糖水平高低的點對點的因果關系，糖尿病有我們未發(fā)現(xiàn)的獨立于血糖升高之外的機制促進動脈粥樣硬化。
　　AMPK是細胞能量代謝的感受器。研究發(fā)現(xiàn)

2、敲除小鼠編碼AMPKα2的基因，血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)明顯的炎癥反應，表現(xiàn)為IkBα蛋白水平下降、NF-κB活化、NADPH氧化酶的蛋白表達上調(diào)以及大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。有關AMPK在AS中的作用，近期發(fā)現(xiàn)二甲雙胍或降脂藥他汀類等均能激活AMPK，產(chǎn)生內(nèi)皮保護作用及抗AS作用。二甲雙胍是目前臨床廣泛應用的口服降糖藥。
　　既往也有研究發(fā)現(xiàn)AMPKα2活化后可以直接進入細胞核并磷酸化A

3、P-2α第219絲氨酸殘基，上調(diào)其轉錄活性，最終參與了吸煙所誘導的腹主動脈瘤(AAA)形成。轉錄因子活化蛋白2α（Activator Protein，AP-2α）是一種轉錄因子，屬于AP-2家族，包括α、β、γ、δ和ε等5個成員，一種典型的結合序列為GCCXXXGGC。而我們分析IkBα的基因啟動子上含有AP-2α的作用結構域。
　　綜上所述，我們提出科學假說:二甲雙胍通過激活AMPK，通過上調(diào)AP-2α/IkBα通路，抗動脈粥樣

4、硬化斑塊形成以及穩(wěn)定斑塊的作用。
　　目的：
　　(1)AMPK激活后是否通過AP-2α上調(diào)IkBα的基因表達;
　　(2)二甲雙胍是否通過激活AP-2α/IkBα抗AS。
　　方法：
　　1、凝膠遷移或電泳遷移率檢測(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)
　　將IκBα基因啟動子（200和1400bp）的DNA與AP-2α重組蛋白在反應緩沖液中溫育。分

5、離混合物，SYBR Green檢測DNA與SYPRO Ruby檢測蛋白從而檢測AP-2α和NF-κB的相互作用。
　　2、染色質(zhì)免疫沉淀技術(ChIP)
　　收集細胞蛋白，用ChIP測定AP-2α與IκBα基因啟動子的結合能力。
　　3、細胞培養(yǎng)
　　(1)小鼠平滑肌細胞應用1mM AICAR刺激細胞24h。收集細胞提取蛋白檢測AMPK、AP-2α、IκBα的蛋白表達。
　　(2)小鼠平滑肌細胞轉染Cont

6、rol shRNA和AP-2α shRNA干擾AP-2α的表達后，1mM AICAR刺激細胞24h，收集細胞檢測IkBα的表達。
　　(3)小鼠平滑肌細胞轉染Control shRNA和AP-2α shRNA后，50ng/μL的TNF和1 mM AICAR刺激24小時，DHE測定活體細胞ROS的水平。
　　4、構建AP-2α慢病毒載體
　　構建三個不同序列的干擾AP-2α的慢病毒載體。轉染MOVAS細胞證實轉錄因子AP

7、-2α干擾效果，篩選干擾效果最優(yōu)序列。
　　5、動物模型的建立
　　(1)雄性ApoE-/-小鼠均購買周齡為8-10周的，給予普食喂養(yǎng)1周后慢病毒尾靜脈注射。根據(jù)轉染病毒的不同以及是否給予二甲雙胍干預，將ApoE-/-小鼠隨機分為4組:(1) Control shRNA組;(2) Control shRNA給予二甲雙胍藥物干預組;(3) AP-2α shRNA組;(4) AP-2α shRNA給予二甲雙胍藥物干預組組。4周后

8、，給予300mg/kg/天的二甲雙胍。所有小鼠全程高脂飲食，8周后實驗結束，ApoE-/-小鼠被處以安樂死。
　　(2)雄性ApoE-/-小鼠均購買周齡為8-10周的，給予普食喂養(yǎng)1周后給予頸總動脈套管手術并給予慢病毒尾靜脈注射。根據(jù)轉染病毒的不同以及是否給予二甲雙胍干預，將ApoE-/-小鼠隨機分為4組，(1) Control shRNA組;(2)Control shRNA給予二甲雙胍藥物干預組;(3) AP-2αshRNA組;

9、(4) AP-2αshRNA給予二甲雙胍藥物干預組。4周后，給予300mg/kg/天的二甲雙胍飲水，并再次給與尾靜脈病毒注射。所有小鼠全程高脂飲食，結束實驗后，小鼠處安樂死取材進行后續(xù)實驗。
　　6、代謝指標的測定
　　試驗結束后，小鼠均麻醉后進行體重測量。小鼠被麻醉后后行心臟左心室穿刺采血，檢測血清中代謝相關指標。
　　7、組織病理學測定
　　分別制備主動脈根部和頸動脈斑塊組織的冰凍切片，HE染色測定斑塊負荷，

10、α-SMA和MOMA-2分別測定平滑肌細胞和巨噬細胞含量，天狼猩紅染色和油紅O染色分別測定膠原含量和脂質(zhì)含量，測定易損指數(shù)。免疫組化染色測定斑塊組織內(nèi)AP-2α;4-HNE;3-NT; Nox4; p47; IKBα。
　　8、Western blot
　　取出凍存與-80℃冰箱中主動脈根部及右側頸動脈組織，提取蛋白，檢測AP-2α的表達。
　　結果：
　　1、AP-2α能夠與IκBα的啟動子特異結合
　　

11、EMSA測定發(fā)現(xiàn)AP-2α重組蛋白能夠與IkBα的DNA體外相互作用。ChIP測定發(fā)現(xiàn)在細胞內(nèi)AP-2α蛋白能夠和IkBα的基因啟動子相互結合。
　　2、AMPK活化增加了AP-2α與IκBα的表達
　　Westernblot結果顯示AICAR激活AMPK后，增加了磷酸化AP-2α和IκBα的表達。
　　3、激活AMPK后，需要通過AP-2上調(diào)IkBα的蛋白表達
　　AP-2αshRNA干擾AP-2α后，激活AM

12、PK不能明顯增加IkBα的蛋白表達。
　　4、激活AMPK后，需要通過AP-2α抑制細胞內(nèi)氧化應激反應
　　DHE測定活細胞內(nèi)ROS的表達，AP-2α shRNA干擾AP-2α后，激活AMPK并不能抑制細胞內(nèi)ROS的含量。
　　5、ApoE-/-小鼠代謝相關指標的檢測
　　體重和血脂檢測結果顯示，ApoE-/-小鼠各組無顯著差異。
　　6、慢病毒在主動脈根部斑塊組織中干擾效率主動脈根部斑塊組織內(nèi)可見明顯GF

13、P綠色熒光。
　　免疫組化以及Westernblot測定主動脈根部組織中AP-2α的蛋白表達量，慢病毒可以有效的干擾AP-2α的表達。
　　7、慢病毒在頸動脈斑塊組織中的干擾效率
　　頸動脈易損斑塊模型的實驗中，病毒轉染2周后，GFP在頸動脈斑塊組織內(nèi)的表達含量明顯增加。Westernblot以及免疫組化結果顯示，慢病毒轉染明顯的減少了斑塊組織中AP-2α的蛋白表達。
　　8、二甲雙胍通過激活AP-2α增加IK-

14、Bα的表達
　　免疫組化的結果顯示二甲雙胍需要通過激活AP-2α增加IK-Bα的表達，慢病毒干擾減少了AP-2α表達后，二甲雙胍不能明顯增加IK-Bα在斑塊組織中的表達。
　　9、二甲雙胍通過激活AP-2α抑制頸動脈斑塊組織內(nèi)氧化應激
　　與Control shRNA組比較，二甲雙胍不能明顯減少AP-2α shRNA組頸動脈斑塊組織中氧化應激指標的表達。
　　10、二甲雙胍抗動脈粥樣硬化作用需要通過激活AP-2α