原卟啉原氧化酶催化機(jī)理及其抑制動(dòng)力學(xué)的研究.pdf

1、原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase,Protox／PPO,EC1.3.3.4)是葉綠素和亞鐵血紅素相同生物合成步驟中的最后一個(gè)酶,其廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中。在原卟啉原氧化酶的催化作用下,無色的原卟啉原Ⅸ被氧化,失掉六個(gè)電子生成共軛的光敏性物質(zhì)原卟啉Ⅸ。
　　 研究表明原卟啉原氧化酶定位在葉綠體和線粒體中,對(duì)于葉綠素和亞鐵血紅素的合成具有重要的作用,這就決定了它在生命體系中具有重要的意

2、義。在人體中,該酶的缺損會(huì)造成顯性遺傳疾病——混合型卟啉癥(Variegated Porphyria,VP)的產(chǎn)生,這種病又稱雜色卟啉病,為一種常染色體顯性遺傳疾病。這種疾病患者的數(shù)量和發(fā)病地域正在不斷擴(kuò)大,因此對(duì)該酶的研究具有重要的醫(yī)學(xué)意義。在植物體內(nèi),原卟啉原氧化酶是光依賴性除草劑的作用靶標(biāo),除草劑與底物競爭性抑制的結(jié)果會(huì)導(dǎo)致綠色植物組織的干枯與白化,從而死亡。這在研發(fā)新型的抑制劑上引起了農(nóng)藥學(xué)家的關(guān)注,因而對(duì)該酶的研究具有重要的農(nóng)

3、學(xué)意義,我們希望從酶水平利用分子生物學(xué)手段,研究抑制劑與酶的作用機(jī)制,從而指導(dǎo)新型抑制劑的合成與研發(fā)。
　　 基于原卟啉原氧化酶在醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)中的重要性,我們主要進(jìn)行了以下四方面的工作:
　　 一、通過對(duì)多種蛋白晶體培養(yǎng)條件的摸索優(yōu)化,對(duì)人體PPO晶體進(jìn)行培養(yǎng),得到了分辨率為1.9(A)的人體PPO與其抑制劑三氟羧草醚(AF)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),為理解人體混合型卟啉癥的發(fā)病機(jī)制和PPO催化機(jī)理的研究提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。

4、r>　　 二、在結(jié)構(gòu)和模擬計(jì)算支持的前提下,識(shí)別了在人體PPO活性空腔中對(duì)催化過程有重要作用的氨基酸殘基,采用DonⅠ突變方法建立了基因突變體系,并對(duì)其活性進(jìn)行測定,驗(yàn)證了這些氨基酸殘基的重要性。
　　 三、對(duì)原卟啉原氧化酶的氧化機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,并且采用stopped-flow的方法測得了O2加速酶反應(yīng)的速率常數(shù),提出了PPO新的催化氧化機(jī)制。
　　 四、通過高通量篩選對(duì)PPO類抑制劑的抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,尋

5、找出了活性更高的化合物,在這些化合物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,通過計(jì)算機(jī)模擬對(duì)不同官能團(tuán)的影響進(jìn)行總結(jié),對(duì)高效新型抑制劑的研發(fā)具有指導(dǎo)意義。
　　 綜上所述,本文從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度對(duì)人體原卟啉原氧化酶進(jìn)行研究,所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)抑制劑的分子設(shè)計(jì)和VP卟啉癥的研究具有指導(dǎo)作用。在此基礎(chǔ)上結(jié)合計(jì)算化學(xué)對(duì)原卟啉原氧化酶與底物、抑制劑、輔助因子之間的相互作用進(jìn)行了研究。本文通過對(duì)抑制劑合理的分子設(shè)計(jì)和高通量篩選,為設(shè)計(jì)高效專一、開發(fā)新型抑制劑提供重