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文檔簡介
1、支氣管哮喘(簡稱哮喘)是多種細胞成分和細胞組分參與的持續(xù)的慢性氣道炎癥性疾病。氣道屏障的破壞和高通透性是哮喘發(fā)病的啟動環(huán)節(jié)。既往研究表明屋塵螨(HDM)能增加氣道上皮屏障的通透性,從而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。然而,其具體機制尚不明確。熱休克蛋白(Hsp)90α通過分泌到細胞外的微環(huán)境(簡稱胞外)而發(fā)揮其促細胞動力作用,目前的研究主要集中在傷口的愈合和腫瘤的轉(zhuǎn)移。RhoA信號是生物體內(nèi)重要的信號,參與了血管內(nèi)皮及腸道的屏障的破壞,抑制Hsp9
2、0可通過破壞src調(diào)節(jié)的RhoA信號保護內(nèi)毒素(LPS)誘導的肺內(nèi)皮細胞的屏障破壞。因此,胞外的Hsp90α(eHsp90α)可能在HDM誘導的氣道上皮屏障破壞中扮演十分重要的作用,同樣,體外研究也進一步表明了抑制表皮生長因子受體信號(EGFR信號)可明顯改善HDM所導致的氣道上皮高通透性,但其具體機制尚不明確。
目的:
1、探討HDM誘導的氣道上皮屏障破壞的具體機制和eHsp90α通過激活RhoA/肌球蛋白輕鏈(M
3、LC)介導HDM誘導的支氣管上皮屏障的破壞。
2、探討HDM對肌動蛋白應力纖維(F-actin)重新排布的影響及EGFR信號在其中的作用。
方法:
通過測量跨膜電阻值(TEER)和右旋糖苷的通透率(FITC-DX)來評估HDM誘導的人支氣管氣道上皮細胞16HBE14o-(16HBE)的屏障功能的破壞,通過免疫蛋白印記法(Western blotting)和免疫熒光(Cofocal)來評估粘附連接蛋白E-ca
4、dherin及β-catenin的表達和分布的情況。通過濃縮和純化條件培養(yǎng)基檢測氣道上皮細胞對eHsp90α的分泌情況。RhoA的活性是通過Rho G-LISA(@)RhoA activation assay kitTM biochem kit試劑盒測定,通過蛋白免疫印記法測定MLC磷酸化水平。另外,應用Western blotting方法檢測HDM對EGFR、磷酸化EGFR及F-actin蛋白水平變化,應用免疫熒光技術(shù)觀察F-acti
5、n的分布變化。
結(jié)果:
與對照組相比,HDM刺激16HBE細胞引起上皮細胞單層的高通透性,表現(xiàn)為TEER值下降和FITC-DX升高,且均在400U/ml的HDM最明顯。同時,HDM亦可引起粘附連接蛋白E-cadherin和β-catenin的在細胞膜上面的分布異常,由細胞膜向胞漿彌散。另外,HDM刺激16HBE細胞時,可以觀察到eHsp90α的分泌是明顯增多,且均在400U/ml的HDM最明顯。
進一步通過
6、慢病毒下調(diào)Hsp90α及預處理eHsp90α的單克隆抗體1G6-D7可以保護HDM誘導的屏障的破壞,表現(xiàn)為TEER和FITC的改善及E-cadherin和β-catenin的分布異常的改善。同時,400U/ml的HDM作用16HBE細胞在6h引起RhoA的活性的增加,而同濃度的HDM可引起MLC的磷酸化水平開始6h升高,24h達最高。然而發(fā)現(xiàn)下調(diào)Hsp90α及預處理eHsp90α的單克隆抗體1G6-D7可以保護HDM誘導的RhoA的活性
7、和MLC的磷酸化水平。進一步使用Rho激酶的抑制劑GSK429286A和Y276322HC1預處理16HBE細胞可以保護HDM誘導的支氣管上皮屏障的破壞,表現(xiàn)為TEER和FITC的改善及E-cadherin和β-catenin的分布異常的改善。另外,人重組(hr)Hsp90α而不是hrHsp90β刺激16HBE細胞亦可以誘導支氣管上皮屏障的高通透性及RhoA/MLC信號的活化。
然后,予EGFR抑制劑AG-1478進行預處理,
8、實驗分為四組:對照組,AG-1478組,HDM組,AG-1478+HDM組。與對照組比較,HDM組磷酸化EGFR表達明顯增多,加入EGFR抑制劑AG-1478后E-cadherin和β-catenin的分布異常及TEER值、FITC-DX通透率均明顯改善。HDM刺激后促進F-actin表達增多并出現(xiàn)重新排布,而EGFR抑制劑AG-1478可明顯抑制這一過程。
結(jié)論:
1、研究證明了eHsp90α通過激活RhoA/ML
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