條紋斑竹鯊TBC1D15蛋白的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、TBC結(jié)構(gòu)域(Rab-GAP)是一段約由200個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的氨基酸序列，幾乎所有真核生物都含有TBC結(jié)構(gòu)域的蛋白。TBC1D15(TBC1 domain family member15)作為含TBC結(jié)構(gòu)域大家族的其中一員，參與多種生理功能，對(duì)生物體具有重要的調(diào)控作用。根據(jù)現(xiàn)有的研究表明，TBC1D15是一種高度保守的蛋白，具有GTP酶激活蛋白活性，同時(shí)對(duì)Rab7也具有明顯的底物偏愛性。TBC1D15能通過調(diào)節(jié)Rab7進(jìn)而來

2、調(diào)節(jié)溶酶體的形態(tài)，此外，它在維持生長因子依賴性上同樣具有重要的作用。條紋斑竹鯊TBC1D15最早是在其肝臟中發(fā)現(xiàn)的，其基因序列包含有4213個(gè)堿基對(duì)。另外，條紋斑竹鯊TBC1D15的N端具有APSL（鯊肝活性肽）結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域與條紋斑竹鯊肝臟再生有關(guān)，能夠降低2型糖尿病小鼠的血糖水平，另外還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抑制脂質(zhì)體氧化的作用。本課題組通過體外酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，條紋斑竹鯊TBC1D15對(duì)Rab7a具有GTP酶激活蛋白活性。盡管我們

3、已經(jīng)通過體外實(shí)驗(yàn)，測定了條紋斑竹鯊TBC1D15的GAP活性，但是對(duì)于這一催化機(jī)制還尚未清楚。到目前為止，也沒有TBC1D15的結(jié)構(gòu)模型來幫助我們解釋這一機(jī)制，因此希望利用晶體學(xué)的方法來解析條紋斑竹鯊TBC1D15的蛋白結(jié)構(gòu)以及其與作用蛋白R(shí)ab的復(fù)合結(jié)構(gòu)。
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)全長的TBC1D15（條紋斑竹鯊Shark、人Homo、豬Sus、鼠Mus）蛋白序列，利用生物信息學(xué)的方法分析Rab-GAP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并對(duì)這四種蛋白分別設(shè)計(jì)4

4、個(gè)不同的截短，通過蛋白的表達(dá)、純化和HPLC鑒定，篩選出性狀最優(yōu)的蛋白。之后通過蛋白的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，初步篩選出適宜的蛋白結(jié)晶條件，再根據(jù)蛋白結(jié)晶條件的優(yōu)化，得到高分辨的蛋白晶體。結(jié)果表明，Sus GAP-2、Shark GAP-2、Homo GAP-2以及Mus GAP-2均具有很好的表達(dá)性質(zhì)，通過蛋白結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，獲得Shark GAP-2和Sus GAP-2這兩種蛋白晶體。通過后續(xù)的蛋白結(jié)晶條件優(yōu)化、數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析工作，得到了分辨率分別

5、為2.8(A)(Shark GAP-2)和2.5(A)(Sus GAP-2)的晶體結(jié)構(gòu)。將這兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)極其相似，這也證明了TBC1D15在進(jìn)化上的高度保守性。另外，與酵母Gyp1p和TBC1D1的結(jié)構(gòu)比較中發(fā)現(xiàn)，盡管它們都是由16個(gè)α螺旋組成，沒有β折疊結(jié)構(gòu)，但還是有很多結(jié)構(gòu)上的差異，這說明了我們分離、純化，解析得到的Shark GAP-2和SusGAP-2晶體結(jié)構(gòu)，是全新的蛋白結(jié)構(gòu)，這也是對(duì)TBC家族蛋白結(jié)構(gòu)的補(bǔ)

6、充。
　　另外，以Rab11a和Rab7a作為底物，對(duì)Shark GAP-2和Sus GAP-2進(jìn)行體外GAP(GTPase-activating protein)活性測定。結(jié)果表明，這兩種蛋白均能夠加速Rab11a和Rab7a水解GTP形成GDP?；赟hark GAP-2和Sus GAP-2的蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)Shark GAP-2和SusGAP-2催化motif上的精氨酸和谷氨酰胺分別設(shè)計(jì)突變:Shark GAP-2(R437A、

7、R437K、Q474A)和Sus GAP-2(R400A、R400K、Q437A)。對(duì)這一系列突變蛋白進(jìn)行GAP體外活性測定，發(fā)現(xiàn)突變后的蛋白活性喪失。這證明了催化motif上的精氨酸和谷氨酰胺是關(guān)鍵的催化氨基酸，其任意一個(gè)突變都將導(dǎo)致GAP活性的喪失。
　　最后，嘗試將Shark GAP-2和Sus GAP-2分別與Rab7a和Rab11a進(jìn)行共表達(dá)和串聯(lián)表達(dá)，以此來得到GAP蛋白與Rab底物蛋白的復(fù)合結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，共表達(dá)方法