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文檔簡介
1、海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng),其多樣獨特的環(huán)境造就了有別于其它生態(tài)環(huán)境的微生物資源,僅海底軟泥中的生物量就占地球總生物量的10%~30%之多。堿性蛋白酶廣泛存在于細菌、真菌和動植物體內(nèi),可用于洗滌、食品、紡織、醫(yī)藥和生命科學等領域,其中洗滌行業(yè)應用最為廣泛。從海洋環(huán)境中篩選出高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株已成為研究熱點。
本研究以遼寧營口海洋淤泥為環(huán)境樣品,采用蛋白酶的活性篩選策略,得到一株產(chǎn)蛋白酶優(yōu)勢菌株。通過微生物形態(tài)學特征、生理生化性
2、質(zhì)、16SrDNA基因鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹等方面的分析,判斷該菌屬于銅綠假單胞桿菌屬,命名為Pseudomonas aeruginosa sp.DES-3。其發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級沉淀和超濾后,測得其最適反應溫度和pH分別為55℃和9.0,在4-55℃和pH7.0-9.0的范圍內(nèi)有很好的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。Fe2+、Ca2+對酶活有明顯促進作用;Zn2+、Cu2+、Fe3+、pb2+、Ni2+對酶活有明顯抑制作用。PMSF會徹底抑制酶活,推
3、測該酶是絲氨酸蛋白酶類,能與部分表面活性劑較好的互溶。
前期實驗室構(gòu)建了宏基因組AL01文庫,編號pGXAA2011擁有一個完整蛋白酶基因的陽性克隆。生物信息學分析結(jié)果表明,該陽性克隆包括的一個長為1146 bp的ORF,編碼381個氨基酸,蛋白分子量約為39.46 kDa,命名該基因為ap02。在氨基酸水平上,與Salinibacillus aidingensis(登錄號為WP_044156525.1)的peptidase基
4、因一致性為100%,該序列來自全基因組測序的功能注釋,暫無其他生化特性研究。
擴增基因ap02與表達載體pET-32a(+)連接轉(zhuǎn)化至Escherichia coliBL21(DE3)pLysS表達宿主中,構(gòu)建重組表達載體。測得粗酶最適反應溫度和pH分別為65℃和9.0,在4-45℃和pH7.0-9.0范圍內(nèi)有很高的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。Ca2+、Mn2+對酶活有明顯激活作用,F(xiàn)e2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+對酶活有明顯
5、的抑制作用。PMSF和EDTA對酶活力有強烈抑制作用,推測該酶屬于絲氨酸蛋白酶類,且有一定的金屬依賴性。
將基因ap02與廣宿主表達載體pMP2444和pBBR1MCS-5連接,轉(zhuǎn)化至以0.3 M蔗糖溶液為電轉(zhuǎn)化介質(zhì)的Pseudomonas aeruginosa sp.DES-3感受態(tài)細胞中,構(gòu)建基因工程菌株。研究發(fā)現(xiàn)在同一溫度下,兩個基因工程菌株的酶活力均比野生菌株DES-3的酶活力稍低,但基因工程菌株DES-3/pBBR1
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