熒光分子探針技術(shù)在基因表達(dá)產(chǎn)物研究中的應(yīng)用.pdf

1、現(xiàn)代科學(xué)認(rèn)為：許多疾病的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平變化有著直接的聯(lián)系。但是，如何借助有效的研究手段，從分子水平上實(shí)時(shí)、靈敏、特異地獲取這些信息變化，尤其是基因表達(dá)信息的變化，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，同時(shí)也為分析化學(xué)加強(qiáng)與醫(yī)學(xué)的融合提供了新的機(jī)遇。熒光分子探針技術(shù)作為一種靈敏、準(zhǔn)確的研究手段和方法，結(jié)合生物大分子的一些特殊生化性質(zhì)，如核酸雜交、核酸-蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)(酶)對(duì)底物的特異性識(shí)別和切割等，將生物分子信息轉(zhuǎn)

2、變?yōu)橐子跈z測(cè)的熒光信號(hào)，有望在獲取基因表達(dá)產(chǎn)物信息方面取得突破。但是，由于受到熒光分子探針類型的限制和基因表達(dá)產(chǎn)物多樣性的影響，目前基于熒光分子探針檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物的方法還不多。因此，進(jìn)一步發(fā)展可用于檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物的熒光分子探針新方法、新技術(shù)和新原理是一項(xiàng)非常有意義的前瞻性研究工作。 本論文以細(xì)胞中能降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的一類基因表達(dá)產(chǎn)物損傷修復(fù)蛋白為研究對(duì)象，利用這些蛋白的催化功能，結(jié)合研制新型熒光分子探針，從檢測(cè)尿嘧啶糖苷酶(

3、UDG)著手，以發(fā)展操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、選擇性好、而且樣品量小的新方法為研究主線，利用新的雙鏈熒光探針建立了損傷修復(fù)蛋白UDG、APE1和T4DNA連接酶的活性分析新方法，利用已有的分子信標(biāo)探針開(kāi)展了損傷修復(fù)蛋白hOGG1活性分析；同時(shí)利用分子信標(biāo)開(kāi)展了基因表達(dá)產(chǎn)物mRNA的定量檢測(cè)研究。這種用于基因表達(dá)產(chǎn)物研究的熒光分子探針技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，一定程度上克服了基于放射性標(biāo)記、凝膠電泳等經(jīng)典分析方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力以

4、及無(wú)法實(shí)時(shí)獲取基因表達(dá)產(chǎn)物信息的缺陷。論文主要內(nèi)容歸納如下： 第一部分熒光分子探針用于基因表達(dá)產(chǎn)物堿基損傷修復(fù)蛋白的檢測(cè)1、利用雙鏈熒光探針建立了簡(jiǎn)單快速的UDG酶活性分析的新方法。UDG酶是一種能特異消除損傷堿基尿嘧啶的蛋白，在防止基因突變，調(diào)節(jié)免疫功能等方面具有重要意義。目前采用的放射性標(biāo)記和電泳分析UDG酶活性的方法，不利于酶促反應(yīng)過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和活性分析。本章設(shè)計(jì)雙鏈熒光探針作為切割底物和檢測(cè)分子，通過(guò)監(jiān)測(cè)尿嘧啶切割過(guò)程中

5、溶液熒光信號(hào)的變化，建立了UDG酶高靈敏分析方法，檢測(cè)下限可達(dá)0.033U/mL：考察了反應(yīng)溶液中金屬離子、化學(xué)藥物以及底物濃度等條件變化對(duì)切割反應(yīng)初速度的影響，開(kāi)展了UDG酶促反應(yīng)機(jī)制和動(dòng)力學(xué)過(guò)程研究；這種新方法還可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中UDG酶活性，檢測(cè)靈敏度與放射性同位素法相當(dāng)。以上結(jié)果不僅證明熒光分子探針技術(shù)用于堿基損傷修復(fù)蛋白活性檢測(cè)的可行性，而且有望為臨床診斷提供新的輔助手段。 2、利用雙鏈熒光探針建立了簡(jiǎn)單、快速

6、的APE1酶活性分析的新方法。APE1是細(xì)胞中水解AP位點(diǎn)的糖苷酶，主要參與堿基損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生命過(guò)程。為了避免傳統(tǒng)的APE1酶活性分析方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的缺陷，我們以含有AP位點(diǎn)的雙鏈熒光探針作為反應(yīng)底物，在均相溶液中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)AP位點(diǎn)水解反應(yīng)過(guò)程，建立了一種APE1酶活性分析的新方法，其線性檢測(cè)范圍為0.024-2U/mL，檢測(cè)下限為0.024U/mL；通過(guò)考察和優(yōu)化溶液的金屬離子、化學(xué)藥物以及底物濃度等實(shí)驗(yàn)條件，

7、在均相溶液中實(shí)現(xiàn)了酶促反應(yīng)機(jī)制和動(dòng)力學(xué)過(guò)程研究；這種新方法還可用于腫瘤細(xì)胞中APE1活性水平的檢測(cè)，與其他方法相比，該方法不僅靈敏度達(dá)到放射性同位素法的水平，而且特異性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，有望在腫瘤早期診斷上發(fā)揮重要作用。 3、利用雙鏈熒光探針建立了DNA連接酶活性分析的新方法。核酸連接是生命科學(xué)中倍受關(guān)注的生命活動(dòng)。其活性分析和機(jī)理研究有助于進(jìn)一步拓展核酸連接反應(yīng)在疾病檢測(cè)、基因載體及核酸修飾與分析等方面的應(yīng)用。利用雙鏈分子探針作為核酸

8、連接的模板和信號(hào)分子，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)降低來(lái)監(jiān)測(cè)T4DNA連接酶反應(yīng)過(guò)程，為連接酶活性分析、連接機(jī)理及其動(dòng)力學(xué)過(guò)程研究提供了一種簡(jiǎn)便快捷的方法。 4、利用單鏈探針?lè)肿有艠?biāo)建立了簡(jiǎn)單、快速的hOGG1酶活性分析的新方法。根據(jù)hOGG1酶能切割損傷堿基8-oxoG和裂解DNA鏈雙重功能的特性，將8-oxoG設(shè)計(jì)在分子信標(biāo)莖部，發(fā)展了一種可作為hOGG1酶底物的新型熒光探針。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)hOGG1酶識(shí)別切割8-oxoG后引起的溶液

9、熒光信號(hào)變化，建立了一種分析hOGG1酶活性的新方法，檢測(cè)線性范圍為0.0125-5U/mL，檢測(cè)下限為0.0125U/mL；通過(guò)考察和優(yōu)化反應(yīng)溶液中金屬離子、化學(xué)藥物以等實(shí)驗(yàn)條件，開(kāi)展了hOGG1酶促反應(yīng)機(jī)制和動(dòng)力學(xué)過(guò)程研究；這種新的熒光分析方法用于多種腫瘤細(xì)胞hOGG1活性水平準(zhǔn)確檢測(cè)的結(jié)果表明：這種新方法可望為臨床腫瘤早期診斷提供輔助手段。 第二部分熒光分子探針用于基因表達(dá)產(chǎn)物mRNA的檢測(cè)5、利用分子信標(biāo)體外定量檢測(cè)腫瘤

10、抑制基因ING1 mRNA的表達(dá)?；谀[瘤抑制基因ING1 mRNA的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)，將其與體外轉(zhuǎn)錄的ING1RNA雜交，得到了ING1分子信標(biāo)/RNA雜交標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過(guò)考察雜交緩沖溶液的離子強(qiáng)度、pH值以及其他核酸分子對(duì)分子信標(biāo)與細(xì)胞mRNA雜交過(guò)程的影響和體系優(yōu)化，在均相溶液中實(shí)現(xiàn)了ING1 mRNA表達(dá)水平的定量檢測(cè)，并利用RT-PCR法驗(yàn)證了檢測(cè)結(jié)果。與其他mRNA檢測(cè)方法相比，該方法簡(jiǎn)單、快速，而且檢測(cè)過(guò)程不經(jīng)過(guò)擴(kuò)