清熱活血解毒法調(diào)控HaCat細(xì)胞PI3K-Akt信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf

1、銀屑病是一種常見的有遺傳背景并受環(huán)境、感染等多種因素影響的慢性復(fù)發(fā)性疾病。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它是Th1-Th17軸占主導(dǎo)地位的自身免疫性系統(tǒng)性炎癥性疾病，可合并心血管疾病、糖尿病、代謝綜合征、抑郁及炎癥性腸病等。近年來有關(guān)銀屑病免疫發(fā)病機(jī)制的研究較多，其中免疫細(xì)胞、遺傳調(diào)控、相關(guān)炎癥分子之間的相互作用越來越受到重視，而信號(hào)傳導(dǎo)途徑的異?？赡茉谄渲衅鸬疥P(guān)鍵作用。
　　研究目的:
　　從信號(hào)通路傳導(dǎo)角度探討清熱活血解毒法（復(fù)方及中藥單

2、體）干預(yù)HaCat細(xì)胞的機(jī)制，研究清熱活血解毒法治療尋常型銀屑病的作用機(jī)制，明確其作用靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　應(yīng)用TNF-α活化HaCat細(xì)胞24小時(shí)，再添加PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性阻滯劑LY294002干預(yù)1小時(shí)，制備實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞模型。觀察清熱活血解毒復(fù)方及中藥單體落新婦苷對經(jīng)TNF-α活化的HaCat細(xì)胞的生物學(xué)行為影響，及PI3K/Akt信號(hào)通路對其的調(diào)控作用。包括采用CCK-8法檢測清熱活血解毒復(fù)方及落

3、新婦苷干預(yù)經(jīng)TNF-α活化的HaCat細(xì)胞的增殖情況;應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)及RT-PCR檢測信號(hào)通路蛋白Akt及CREB的表達(dá)，以及凋亡基因bax、bcl-xl及c-fos的表達(dá);采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析細(xì)胞各周期分布情況及細(xì)胞凋亡率;采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。
　　研究結(jié)果:
　　(1)清

4、熱活血解毒復(fù)方能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt蛋白及基因的表達(dá)，并且在Akt蛋白的抑制中呈現(xiàn)劑量依賴;信號(hào)通路被阻滯后，抑制作用雖仍然存在，但與通路阻斷前相比，差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，清熱活血解毒復(fù)方對CREB蛋白及基因的表達(dá)均有明顯抑制作用，且隨著劑量的增加而增強(qiáng)，尤其是在應(yīng)用高劑量(30mg/ml)時(shí);信號(hào)通路被阻滯后，復(fù)方對CREB的抑制作用較阻斷前有所減弱。
　　清熱活血解毒復(fù)方對經(jīng)TNF-α活化的HaCat細(xì)胞

5、具有良好的抑制增殖作用;在信號(hào)通路被阻斷后，細(xì)胞的增殖繼續(xù)受到抑制。清熱活血解毒復(fù)方對TNF-α活化的HaCat細(xì)胞凋亡的影響主要表現(xiàn)在促進(jìn)其早期凋亡;通路被阻斷后，復(fù)方可使HaCat細(xì)胞的早期凋亡率繼續(xù)上升，晚期凋亡率下降。清熱活血解毒復(fù)方可使HaCat細(xì)胞大量阻滯于S期而無法進(jìn)入有絲分裂期，從而發(fā)揮其抑制HaCat細(xì)胞增殖的作用;在通路被阻斷后，復(fù)方使HaCat細(xì)胞G0/G1期所占比重增加，S期下降。
　　清熱活血解毒復(fù)方可上

6、調(diào)bax的表達(dá)，并且該上調(diào)作用與復(fù)方劑量呈現(xiàn)依賴性;在通路被阻斷后，復(fù)方對bax的上調(diào)能力受到影響，這種影響在高劑量組中表現(xiàn)的尤為突出。清熱活血解毒復(fù)方可降低TNF-α活化的HaCat細(xì)胞中bcl-xl的表達(dá);在通路被阻斷后，復(fù)方的下調(diào)作用較之阻斷前有所加強(qiáng)。清熱活血解毒復(fù)方可降低TNF-α活化的HaCat細(xì)胞中c-fos的表達(dá)，而且下調(diào)作用與復(fù)方劑量相關(guān);在通路被阻斷后，復(fù)方對于c-fos蛋白的表達(dá)在阻滯前后無明顯變化。
　　清

7、熱活血解毒復(fù)方能夠抑制HaCat細(xì)胞中IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的分泌。PI3K/Akt信號(hào)通路在這些炎癥因子的分泌中均起到調(diào)節(jié)作用，同時(shí)在復(fù)方抑制HaCat細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-1β及IL-6的作用存在密切的聯(lián)系，而在IL-8的分泌上則未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。
　　(2)落新婦苷可以抑制經(jīng)TNF-α活化的HaCat細(xì)胞中Akt的表達(dá)，抑制作用隨劑量的增加而增強(qiáng)，并在Akt蛋白的抑制上呈現(xiàn)劑量依賴;在阻滯通路后，

8、落新婦苷對Akt的表達(dá)較阻滯前有所減弱。落新婦苷對CREB則有較好的抑制作用，在CREB蛋白的抑制上呈現(xiàn)劑量依賴;在阻斷通路后，落新婦苷對CREB的抑制作用較阻斷前相比繼續(xù)增強(qiáng)。
　　落新婦苷能夠抑制經(jīng)TNF-α活化的HaCat細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨著劑量的增加而增強(qiáng);在阻斷PI3K/Akt通路后，落新婦苷的抑制增殖作用較前減弱，但隨著時(shí)間的推移，落新婦苷的抑制增殖作用比未阻斷通路時(shí)增強(qiáng)。落新婦苷可使經(jīng)TNF-α活化的HaCat

9、細(xì)胞S期的細(xì)胞數(shù)量增多，G0/G1期及G2/M期的細(xì)胞數(shù)量同時(shí)減少;在通路被阻滯后，落新婦苷使HaCat細(xì)胞G0/G1期與G2/M期的細(xì)胞數(shù)量持續(xù)減少，S期細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加。
　　落新婦苷在經(jīng)TNF-α活化的HaCat細(xì)胞中對bax具有上調(diào)作用，該作用隨劑量的增加而增強(qiáng);在通路被阻斷后，上調(diào)作用較阻斷前有所增強(qiáng)。面對bcl-xl的表達(dá)，落新婦苷則有抑制作用，同樣在阻斷通路后，該抑制作用有所加強(qiáng)。落新婦苷對原癌基因c-fos的表達(dá)有

10、明顯的抑制作用;在通路被阻斷后，落新婦昔對c-fos的干預(yù)作用較阻斷前有所減弱。
　　落新婦苷可以抑制HaCat細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-8的水平，并且對于前三種細(xì)胞因子的抑制作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。PI3K/Akt信號(hào)通路在除落新婦苷對IL-1β的干預(yù)有較為密切的關(guān)系以外，對其他細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6及IL-8的干預(yù)均未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。
　　研究結(jié)論:
　　P