小檗堿通過(guò)抑制脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)改善胰島素抵抗的研究.pdf

1、本課題基于2型糖尿病的中醫(yī)病機(jī)“燥熱內(nèi)盛”及現(xiàn)代研究“炎癥學(xué)說(shuō)”的最新發(fā)展，把“燥熱內(nèi)盛”的中醫(yī)理論與肥胖進(jìn)一步發(fā)展成為胰島素抵抗(IR)及2型糖尿病的研究相結(jié)合，提出肥胖的中醫(yī)病機(jī)“燥熱內(nèi)盛”，采用“清熱解毒”法治療，達(dá)到降血糖、治療2型糖尿病的目的。本研究選用臨床常用的清熱解毒藥之一黃連的主要成分小檗堿(BBR)做為研究的代表藥物，觀察其對(duì)肥胖相關(guān)IR的影響。探討IR相關(guān)2型糖尿病“燥熱內(nèi)盛”病機(jī)、“炎癥學(xué)說(shuō)”研究及“清熱解毒”治法

2、之間的聯(lián)系，提出清熱解毒方藥的降糖機(jī)制。
　　目的：
　　通過(guò)高脂喂養(yǎng)C57BL/6lasc小鼠和培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞及誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞，觀察黃連的主要成分BBR對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度與肥胖相關(guān)胰島素敏感性的影響。本課題研究了BBR降低肥胖小鼠體重、減少脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、改善IR的藥理作用，豐富了中藥單體減肥降糖的理論認(rèn)識(shí)，對(duì)明確中醫(yī)藥降糖新作用有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。
　　方法：
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

3、:1）建立高脂喂養(yǎng)C57BL/6lasc小鼠，18周復(fù)制肥胖動(dòng)物模型并評(píng)價(jià)胰島素的敏感性指標(biāo)，病理學(xué)采用HE染色法觀察脂肪細(xì)胞大小并測(cè)量脂肪細(xì)胞直徑，同時(shí)用小檗堿(BBR)，同時(shí)選取羅格列酮(RSG)作為陽(yáng)性對(duì)照藥干預(yù)15天進(jìn)行藥效研究。2）采用流式細(xì)胞儀分析脂肪組織巨噬細(xì)胞(ATMs)數(shù)量并用western bloting檢測(cè)脂肪組織炎癥信號(hào)通路及胰島素信號(hào)通路，采用real time PCR檢測(cè)脂肪組織MCP-1、IL-6、TNF-

4、α的基因表達(dá)。3）ELISA法檢測(cè)C57BL/6lasc小鼠血清的MCP-1含量。
　　體外實(shí)驗(yàn):1）培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞及誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞。用葡萄糖氧化酶法觀察10umol/L小檗堿干預(yù)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)液對(duì)脂肪細(xì)胞糖消耗情況。2）采用western bloting法檢測(cè)炎癥信號(hào)通路JNK(Thr183/185)、NF-κ B/P65、P-IKKβ(ser181)蛋白的磷酸化活化。3）采用trans well共培養(yǎng)系統(tǒng)

5、，利用蘇木精-伊紅法對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察并統(tǒng)計(jì)3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞趨化數(shù)量，同時(shí)用ELISA法檢測(cè)3T3-L1脂肪細(xì)胞上清MCP-1的含量。
　　結(jié)果：
　　1、以TNF-α為代表的細(xì)胞因子能夠激活脂肪細(xì)胞JNK、IKKβ炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6、TNF-α及MCP-1的基因表達(dá)上調(diào)，增加Ser307蛋白磷酸化的活化，降低胰島素的敏感性，使葡萄糖消耗下降。2、LPS促進(jìn)JNK、IKKβ

6、/NF-κB信號(hào)通路的活化磷酸化，使細(xì)胞因子IL-6、TNF-α及MCP-1基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞表現(xiàn)為炎癥狀態(tài)。3、高脂飼料喂養(yǎng)18周的小鼠體重、血清MCP-1、FBG、FINS水平顯著升高，HOMR指數(shù)＞1，胰島素敏感性降低。4、小檗堿可以抑制JNK、IKKβ/NF-κB炎癥信號(hào)通路，抑制IL-6、TNF-α炎癥因子及趨化因子MCP-1的基因表達(dá)，同時(shí)抑制了ATMs的浸潤(rùn)數(shù)量，抑制絲氨酸307位點(diǎn)（Ser307）蛋白磷酸化的活化，恢復(fù)了