大鼠心肌、骨骼肌細(xì)胞DNA含量變化與死亡時(shí)間的相關(guān)性研究.pdf

1、死亡時(shí)間(postmortem interval，PMI)是指從死亡發(fā)生到發(fā)現(xiàn)或檢查尸體時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，又稱死后間隔時(shí)間。死亡時(shí)間推斷一直是法醫(yī)工作中的重點(diǎn)及難點(diǎn)問題，至今仍沒有找到簡便、易操作、準(zhǔn)確性高的單一技術(shù)方法。死亡時(shí)間的準(zhǔn)確推斷可以為刑事案件特別是重大命案的偵查，縮小偵察范圍，對確定兇犯和排除嫌疑人及后續(xù)審理工作等提供科學(xué)依據(jù)，具有非常重要的意義。大部分他殺受害者在48小時(shí)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，能夠最大可能準(zhǔn)確快速推斷死亡時(shí)間是破案的關(guān)鍵

2、所在。同時(shí)隨著現(xiàn)代社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，各項(xiàng)法律法規(guī)的漸趨完善，死亡時(shí)間的科學(xué)推斷在財(cái)產(chǎn)繼承、保險(xiǎn)及醫(yī)療糾紛等方面也具有一定意義。 目前，在法醫(yī)實(shí)際工作中一般需要綜合尸體現(xiàn)象、超生反應(yīng)、胃內(nèi)容物、昆蟲演變、植物生長及環(huán)境氣候等因素分析推斷，然而由于受各種外界環(huán)境因素(溫度、濕度)的影響，其準(zhǔn)確性往往不能令人滿意。 目前推斷死亡時(shí)間方式有多種。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，法醫(yī)學(xué)家不停嘗試用各種檢測方法，從細(xì)胞、蛋白質(zhì)甚至分子水平進(jìn)行研究

3、，為推斷死亡時(shí)間積累了許多寶貴的資料。近年來，隨著組織細(xì)胞DNA定量檢測技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用細(xì)胞核DNA的變化來推斷死后時(shí)間也是國內(nèi)外法醫(yī)病理學(xué)研究的熱點(diǎn)，有望成為一種新的方法。相對于其他尸體材料而言，細(xì)胞核DNA的變化很少受到外界條件改變的干擾，因而適用于死亡時(shí)間的推斷是許多法醫(yī)學(xué)者的共識。 1. 目的: DNA作為生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，其含量相當(dāng)穩(wěn)定。在相同種屬不同個(gè)體的含量相同，不論雌性與雄性還是成年與幼年。隨著DNA檢

4、測技術(shù)(如DNA組織化學(xué)測定技術(shù)、流式細(xì)胞儀測定技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)、彗星電泳等)的提高。應(yīng)用DNA測定技術(shù)推斷死亡時(shí)間成為一種很有希望的精確推斷PMI的方法。本研究選擇大鼠的心肌和骨骼肌作為研究對象，著重探討下列問題： (1)分別測定大鼠心肌、骨骼肌細(xì)胞中DNA含量隨著死亡時(shí)間的變化，探討其相關(guān)性。 (2)分別觀察大鼠心肌、骨骼肌細(xì)胞核DNA含量的變化，探討與死亡時(shí)間之間的關(guān)系。 2.方法: 2．1

5、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與動(dòng)物模型制作取成年健康SD雌性大鼠18只，體重約150g-200g左右(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為9組，每組2只。以死亡即刻取材兩只作為對照組；每個(gè)組內(nèi)再分為心臟組，骨骼肌組。 2．2檢材提取與前期處理大鼠頸椎脫臼處死，尸體存放于22℃室溫下，每只大鼠均取心，骨骼肌相同位置取為檢材組織，分別在不同的時(shí)間段1 h，3 h，6 h，12 h，1 8 h，24 h，48 h，72 h取材。所有標(biāo)本一部分組織塊剪

6、碎(約綠豆大小)，用于抽提，DNA。另一部分標(biāo)本(心臟最大切面，大腿內(nèi)收肌)10﹪福爾馬林固定后，制作常規(guī)石蠟切片備用。 2．3 DNA降解的檢測(TdT法)用等體積飽和酚和氯仿抽提DNA。用紫外分光光度計(jì)測吸光度，獲取DNA的濃度和所提取DNA的純度。在TdT反應(yīng)體系中，采用DNA3’末端標(biāo)記法(TdT法)，將dUTP結(jié)合到DNA3’末端，檢測反應(yīng)剩余的dUTP的量，即可推測機(jī)體死后不同時(shí)間內(nèi)DNA的降解情況。應(yīng)用SPSS 1

7、3.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件對各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本單因素方差分析；用兩組配對樣本均數(shù)t檢驗(yàn)的方法分別進(jìn)行組問和組內(nèi)比較，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)以p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2．4形態(tài)學(xué)觀察對制作好的石蠟切片分別進(jìn)行分別進(jìn)行HE和改良的Feulgen法染色，對染色結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下觀察染色變化作形態(tài)學(xué)觀察及圖像分析，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 3.結(jié)果: 3．1 HE和改良的Feulge

8、n法染色 3．1．1 HE染色 (1)對照組肌纖維排列整齊，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，多為圓形或橢圓形，染色均勻，肌纖維及橫紋清晰可見。 (2)實(shí)驗(yàn)組顯示在死后3h細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。在死后6h均可見灶性的組織自溶現(xiàn)象，細(xì)胞輪廓逐漸變模糊，細(xì)胞問界限不明顯，細(xì)胞質(zhì)透明，染色淡染，至死亡72h肌纖維排列疏松，部分肌纖維斷裂死，但仍可見肌纖維橫紋。隨著死亡時(shí)間的延長，細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞核溶解，殘存的細(xì)胞核著色逐漸變淡。

9、 3．1．2改良Feulgen染色 (1)對照組細(xì)胞核染色較深，呈深紫紅色，多為圓形或橢圓形，大小一致，輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整。 (2)實(shí)驗(yàn)組死后3h細(xì)胞核DNA染色呈深紫紅色，細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)則，大小較為一致，輪廓清晰。隨著死亡時(shí)間延長，細(xì)胞DNA著色逐漸由深紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榈霞t色，核仁消失，細(xì)胞核邊緣逐漸模糊，界限不清，形態(tài)不規(guī)則。大部分的細(xì)胞核由圓形變?yōu)槟：狞c(diǎn)狀或片狀結(jié)構(gòu)，48h單位面積內(nèi)細(xì)胞核的數(shù)量逐漸減少，大

10、部分細(xì)胞核著色淺淡，可見核固縮及核碎裂，72h只能看見殘留的少量染色質(zhì)碎片。 3.2 HE和改良的Feulgen法 染色圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算機(jī)圖像分析顯示隨著死亡時(shí)間的延長，心肌、骨骼肌組織的積分灰度級(IG)在各個(gè)死亡時(shí)間點(diǎn)依次呈下降趨勢(P<0.05)。心肌組圖像平均灰度級(AG)呈緩和的上升趨勢(P>0.05)。而骨骼肌組圖像平均灰度級(AG)呈較平緩的下降趨勢(P>0.05)。以死亡時(shí)間(PMI)為自變量(

11、x)，分別以積分灰度級(IG)和平均灰度級(AG)為因變量(Y)，作散點(diǎn)圖和一元回歸分析。 回歸方程如下： IG(心肌)：y=33.406-0.001x(R<'2>=0.518 P<0.05) AG(心肌)：y=0.149x-5.463 (R<'2>=0.012 P>0.05) IG(骨骼肌)：y=26.835.0.001x (R<'2>=0.349 P<0.05) AG(骨骼肌)：y=28.905-0.084x (R<'2>=

12、0.003 P>0.05)3.3 TdT法隨著機(jī)體PMI的延長，心肌和骨骼肌組織分別加入TdT酶DNA反應(yīng)體系后，dUTP的吸光度數(shù)值逐漸減小，即DNA末端轉(zhuǎn)移反應(yīng)后剩余的dUTP的量在減少(P<0.05)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，可以推測出在反應(yīng)中結(jié)合到DNA3'末端的dUTP的量逐漸增多，可以得出隨著PMI的延長，機(jī)體心肌、骨骼肌細(xì)胞DNA降解片段越來越多，從而證實(shí)了機(jī)體細(xì)胞DNA含量是隨著PMI的延長而逐漸減少。 4.結(jié)論: