幽門螺桿菌表位特異性CD4+T細(xì)胞免疫保護(hù)機制及CD8+T細(xì)胞應(yīng)答特征研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)為革蘭陰性菌，螺旋桿狀，感染后定植于人和多種動物胃粘膜局部，導(dǎo)致胃炎，胃十二指腸潰瘍及胃癌等多種胃腸疾病。1994年，H.pylori已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為一類致癌因子。目前H.pylori全球平均感染率超過50％。針對H.pylori感染病人，臨床醫(yī)生多采用聯(lián)合多種抗生素及質(zhì)子泵抑制劑進(jìn)行治療。然而，由于抗生素濫用，耐藥菌株逐年增多，加之抗生素療法成本較高，

2、且伴有不良反應(yīng)，尋求新的有效的治療手段成為目前研究的重點。疫苗接種作為控制病原微生物感染的重要方式，有望成為預(yù)防和抵抗H.pylori感染及相關(guān)疾病發(fā)生的有效手段。
　　本課題在研究保護(hù)性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答類型及其保護(hù)機制過程中，發(fā)現(xiàn)H.pylori感染后可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。H.pylori為胞外感染菌，主要引起CD4+T細(xì)胞而非CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。但已有研究觀察發(fā)現(xiàn):H.pylori可有效侵襲并定植于樹突細(xì)胞，胃上皮細(xì)胞，

3、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)。另有研究報道表明，H.pylori感染豬后，粘膜局部可觀察到明顯的CD8+T細(xì)胞增殖反應(yīng)。臨床病人樣本研究進(jìn)一步證實H.pylori感染可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。然而對于H.pylori感染誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的免疫學(xué)特征及其進(jìn)一步的作用機制尚不明確。
　　本課題中，我們選用保護(hù)性抗原UreB作為模式抗原免疫小鼠，建立保護(hù)性小鼠模型，體外擴增培養(yǎng)抗原特異性T細(xì)胞，并對抗原特異性Th1，Th2，Th17及抗

4、體功能進(jìn)行研究。同時篩選鑒定了UreB抗原中的優(yōu)勢Th表位，并評價了優(yōu)勢應(yīng)答表位的免疫保護(hù)效果。探討了表位特異性Th1應(yīng)答免疫保護(hù)機制。為全面了解H.pylori感染后機體免疫應(yīng)答特征，揭示H.pylori持續(xù)定植感染機制，我們對H.pylori感染后CD8+T細(xì)胞尤其是粘膜局部浸潤的CD8+T細(xì)胞表型特征及特異性細(xì)胞因子分泌情況進(jìn)行初步探討。
　　目的:
　　1.闡釋幽門螺桿菌感染后表位特異性CD4+T細(xì)胞免疫保護(hù)機制

5、r>　　通過UreB抗原免疫小鼠建立保護(hù)性小鼠模型，體外擴增抗原特異性CD4+T細(xì)胞，評價特異性T細(xì)胞在H.pylori感染中的免疫保護(hù)效果。通過篩選并鑒定UreB中的優(yōu)勢Th表位，確定其MHC限制性及自然遞呈特性，評價優(yōu)勢應(yīng)答表位的免疫保護(hù)效果，篩選可用于表位疫苗設(shè)計的候選表位，進(jìn)一步探討表位特異性CD4+T細(xì)胞免疫保護(hù)機制。
　　2.探討幽門螺桿菌感染后CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答特征
　　通過建立H.pylori感染小鼠模型

6、，明確感染后CD8+T細(xì)胞尤其是粘膜局部特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答類型，增殖特性，特異性細(xì)胞因子分泌等免疫應(yīng)答特征，以全面了解H.pylori感染后機體免疫應(yīng)答情況，并初步探討H.pylori誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的可能機制。
　　研究方法
　　1.幽門螺桿菌感染后表位特異性CD4+T細(xì)胞免疫保護(hù)機制研究
　　SPF級雌性BALB/c小鼠經(jīng)UreB抗原聯(lián)合弗氏佐劑行四肢皮下注射免疫，建立抗原保護(hù)性小鼠模型;3H摻入實驗及

7、RT-PCR檢測UreB抗原免疫后小鼠特異性CD4+T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌;抗原特異性CD4+T細(xì)胞體外擴增后經(jīng)流式檢測特異性細(xì)胞因子表達(dá)譜;利用合成系列重疊肽，篩選UreB抗原中的優(yōu)勢應(yīng)答表位;MHC抗體特異性阻斷細(xì)胞表面MHC分子，明確優(yōu)勢應(yīng)答表位的MHC限制性;誘導(dǎo)骨髓源樹突細(xì)胞(BM-DCs)，負(fù)載抗原后與表位特異性T細(xì)胞共培養(yǎng)，評價優(yōu)勢表位自然遞呈特性;通過比較篩選表位與預(yù)測表位免疫應(yīng)答能力，評價篩選表位優(yōu)勢應(yīng)答特性;優(yōu)勢表

8、位與CpG佐劑預(yù)混合后滴鼻免疫小鼠，行H.pylori灌胃感染，Real-time檢測粘膜局部細(xì)菌定植量，評價優(yōu)勢應(yīng)答表位免疫保護(hù)效果;通過表位特異性CD4+T細(xì)胞過繼免疫實驗及IL-17-/-小鼠，明確表位特異性CD4+T細(xì)胞免疫保護(hù)功能;通過檢測表位特異性CD4+T細(xì)胞表面歸巢受體及趨化因子受體，并結(jié)合粘膜局部CD4+T細(xì)胞浸潤情況，初步探討表位特異性CD4+T細(xì)胞免疫保護(hù)機制。
　　2.幽門螺桿菌感染后CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答

9、特征
　　采用2×108 CFU H.pylori連續(xù)灌胃BALB/c小鼠，建立小鼠感染模型;通過EDTA，DTT處理感染后小鼠胃組織，提取粘膜局部浸潤CD8+T細(xì)胞，流式檢測H.pylori感染后粘膜CD8+T細(xì)胞的數(shù)量變化及表型特征;通過流式，CCK8及CFSE檢測CD8+T細(xì)胞特異性增殖情況;通過UreB抗原體外刺激培養(yǎng)，擴增抗原特異性CD8+T細(xì)胞，明確H.pylori誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中的交叉遞呈途徑;利用合成系列重

10、疊肽，篩選UreB抗原中的優(yōu)勢應(yīng)答表位;誘導(dǎo)骨髓源樹突細(xì)胞(BM-DCs)，負(fù)載抗原后與表位特異性CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，評價優(yōu)勢表位自然感染下交叉遞呈特性;通過ICS及FCM對粘膜CD8+T細(xì)胞細(xì)胞因子，歸巢受體及趨化因子進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果
　　1.幽門螺桿菌感染后表位特異性CD4+T細(xì)胞免疫保護(hù)機制研究
　　1.1 UreB抗原免疫后誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性Th1及Th17應(yīng)答。從UreB抗原中篩選到兩個優(yōu)勢T細(xì)胞表位，

11、UreB317-329和UreB409-421。表位免疫后，可同時誘導(dǎo)產(chǎn)生強烈的Th1及Th17應(yīng)答。
　　1.2 優(yōu)勢表位UreB317-329和UreB409-421可在自然狀態(tài)下被抗原遞呈細(xì)胞遞呈至細(xì)胞表面。UreB409-421特異性Th1及Th17應(yīng)答可被MHC-Ⅱ(I-A)抗體特異性阻斷。UreB317-329特異性Th1應(yīng)答可被MHC-Ⅱ(I-A)抗體阻斷，而其特異性Th17應(yīng)答可被MHC-Ⅱ(I-A)和MHC-Ⅱ(

12、I-E)抗體所阻斷。
　　1.3 表位UreB317-329和UreB409-421較已發(fā)表的預(yù)測表位UreB229-244，UreB237-251，UreB546-561可誘導(dǎo)更為強烈的Th1應(yīng)答。且此兩個表位難以通過生物學(xué)軟件有效預(yù)測得到。
　　1.4 UreB317-329和UreB409-421免疫后可有效降低胃粘膜局部H.pylori定植量，并可降低局部炎癥損傷程度。
　　1.5 UreB317-329和Ur

13、eB409-421特異性T細(xì)胞TCRVb存在明顯差異。同一表位特異性Th1及Th17細(xì)胞間Vb表達(dá)趨勢一致。
　　1.6細(xì)胞表面歸巢受體及趨化因子受體，L-selectin及α4β7參與Th1細(xì)胞抗H.pylori保護(hù)性免疫應(yīng)答過程。
　　2.幽門螺桿菌感染后CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答特征
　　2.1 H.pylori感染后，胃粘膜局部CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且與CD4+T細(xì)胞相比，粘膜局部CD8+T細(xì)胞增殖更為明顯。

14、
　　2.2 胃粘膜局部浸潤的CD8+T細(xì)胞為經(jīng)典CD8+T細(xì)胞類型。表面TCR分子為TCRαβ+，且較少觀察到CD8αα+T細(xì)胞及γ8 T細(xì)胞。
　　2.3 H.pylori感染后，粘膜局部浸潤的CD8+T細(xì)胞可針對H.pylori活菌及H.pylori超聲上清抗原產(chǎn)生特異性增殖反應(yīng)。
　　2.4 H.pylori感染后，粘膜局部CD8+T細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子類型為IFN-γ及TNFα。
　　結(jié)論
　　

15、1.本課題建立從抗原保護(hù)小鼠模型中擴增抗原特異性T細(xì)胞，并對抗原中優(yōu)勢應(yīng)答表位進(jìn)行篩選鑒定的方法。利用系統(tǒng)方法對UreB抗原中的優(yōu)勢應(yīng)答表位進(jìn)行了全面篩選及特性鑒定，并證實此方法得到的表位較預(yù)測法所得表位具有更強的免疫應(yīng)答優(yōu)勢。鑒定得到兩個具有良好免疫保護(hù)效果的優(yōu)勢應(yīng)答表位，可用于后續(xù)表位疫苗的研發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)表位特異性Th1細(xì)胞介導(dǎo)了機體抗H.pylori的保護(hù)性免疫應(yīng)答，Th17可能參與了H.pylori感染后的炎性損傷過程。歸巢受

16、體及趨化因子受體在表位特異性Th1細(xì)胞抗H.pylori免疫保護(hù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。課題所得結(jié)果將利于我們進(jìn)一步了解機體抗H.pylori保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)相關(guān)疫苗的研發(fā)。
　　2.本課題證實H.pylori感染后除CD4+T細(xì)胞外同時可有效誘導(dǎo)粘膜局部CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。首次對H.pylori感染后胃粘膜局部浸潤CD8+T細(xì)胞表型進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。研究證實細(xì)胞表面歸巢受體及趨化因子受體在H.pylori感染后粘膜CD8+T