細胞因子誘導的殺傷細胞及樹突狀細胞的優(yōu)化培養(yǎng).pdf

1、背景:我國是乙型肝炎病毒感染的高發(fā)地區(qū),目前HBsAg攜帶率達7.18％,超過1.1億人,需要進行抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者約為2000萬,其中25％～40％可發(fā)展為肝硬化和肝癌:每年約70萬人死于乙肝相關并發(fā)癥,包括肝硬化(liver cirrhosis,LC)、肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),乙肝病毒感染嚴重威脅著人民的生命健康。目前尚無根治HBV感染的藥物,我國慢性乙型肝炎抗病毒治療專家共識及慢

2、性乙型肝炎防治指南中對慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)的總體治療目標是:最大限度地長期抑制或消除HBV,減輕肝細胞炎癥壞死及肝纖維化,延緩疾病進展,減少和防止肝臟失代償、LC、HCC及其并發(fā)癥的發(fā)生,從而改善生活質量和延長存活時間。推薦的乙肝藥物包括干擾素和核苷(酸)類似物,目前上市的推薦藥物對慢性乙型肝炎治療的長期療效有限,例如已上市核苷類似物雖然口服給藥,使用方便,但療程不確定,僅局限于抑制HBV

3、 DNA的復制,對肝細胞核內的復制模板cccDNA無清除作用,而且在抑制HBV復制后,如果沒有發(fā)生HBeAg和(或)HBsAg的血清學轉換,停藥后出現(xiàn)較高的復發(fā)率,同時,耐藥的發(fā)生以及何時停藥等,也是困擾臨床醫(yī)師和患者的重要問題；干擾素雖然較少出現(xiàn)復發(fā)和耐藥,但有效率僅有30％左右,且注射途徑應用不便,不良反應較多,并有應用人群的局限性。因此,臨床上迫切需要探索新的治療方法,以解決目前抗病毒治療過程中存在的問題。
　　 近年來的

4、研究表明,慢性乙型肝炎之所以久治不愈,與患者體內的免疫水平相對低下,多種免疫細胞的數(shù)量減少且有功能缺陷,導致患者自身的免疫系統(tǒng)不能有效清除乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)有關。HBV侵犯肝臟細胞,在肝細胞內復制繁殖而不能被清除,造成肝臟炎癥的同時引起肝臟的慢性纖維化,最終發(fā)展成為肝硬化和肝癌。要最大限度的清除病毒、緩解和減輕肝臟的炎癥、阻止肝纖維化向肝硬化和肝癌的進展,除了應用抗病毒治療外,增加自身免疫細胞數(shù)量、增

5、強患者免疫系統(tǒng)的功能、進行免疫重建是一條治療CHB的新思路,因此,免疫細胞治療是非常值得嘗試的技術手段。
　　 細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK細胞)治療技術是免疫細胞治療技術的一種,其作用機理可能是通過自體免疫細胞對病毒感染細胞的細胞毒性和分泌多種細胞因子(如:IFN-γ)發(fā)揮抑制或清除患者體內的HBV的作用。目前國家衛(wèi)生部發(fā)布了首批應用的第三類醫(yī)療技術目錄,自體免疫細

6、胞治療技術被明確列入了第三類醫(yī)療技術目錄。目前已有應用CIK細胞治療CHB的臨床報道。
　　 樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)。體內、體外研究均表明DC是機體免疫反應的始動者,可有效的激活細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介導的免疫反應。目前研究顯示:CHB患者體內DC功能不全可能是

7、導致CHB慢性化的原因之一。
　　 本實驗通過比較不同培養(yǎng)條件對CIK細胞及DC的影響,并初步探討DC對CIK的作用,為今后的臨床應用提供質量可靠的CIK及DC細胞。
　　 目的:探討體外不同培養(yǎng)條件對CIK細胞及DC的影響,通過比較,摸索最佳的CIK細胞及DC的體外培養(yǎng)條件,以符合臨床應用的需求。并初步探討DC對CIK細胞的作用。
　　 方法:在細胞因子條件相同的情況下,應用不同培養(yǎng)基(AIM V,OpTmiz

8、er)培養(yǎng)CIK細胞；在培養(yǎng)基相同的情況下,應用不同亞型的抗CD3單克隆抗體(antiCD3 monoclonal antibody,antiCD3-mAb)UCHT1、OKT3誘導CIK細胞。應用粒細胞集落刺激因子(Human granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,GM—CSF)及白介素4(interleukin4,IL-4)常規(guī)誘導DC細胞,不同的培養(yǎng)基(RPMI1640、A

9、IM V、PAA(Quantum007 for lymphocytes,PAA))培養(yǎng)DC細胞；應用不同的促成熟方案(cocktail、tumor necrosis factorα(TNF—α))促DC細胞成熟；自體及不同濃度的異體血漿培養(yǎng)DC細胞。將負載HBcAg并促成熟的DC細胞與CIK細胞共孵育。
　　 結果:
　　 1.應用AIMV、及OpTmizer體外培養(yǎng)CIK細胞,CIK細胞大小不一,形狀各異:圓形,長條形

10、、不規(guī)則形；部分細胞形成集落生長。在培養(yǎng)的第14天,OpTmizer與AIM V比較細胞擴增倍數(shù)為27.52:9.45(P<0.05)；細胞表型比較,0天時,CD56+細胞比例為(27.17±9.32)％,第14天時,AIM V組升至(65.20±21.67)％,而OpTmizer組升至(66.97±21.42)％,兩組與基線比較p<0.05;0天時,CD3+CD56+細胞比例為(6.00±5.66)％。第14天時,AIM V組升至(3

11、3.34±21.89)％,OpTmizer組升至(26.81±21.90)％,兩組比較無顯著性差異,但與基線比較,AIM V組p<0.01,OpTmizer組p<0.05。選取3例行對K562的細胞毒性試驗,當效靶比分別為40:1、20:1、10:1、5:1時,AIM V與OpTmizer比較無顯著性差異。
　　 2.應用同種異型的anti-CD3mAb(UCHT1、OKT3)培養(yǎng)CIK細胞,顯微鏡下觀察,兩種培養(yǎng)條件下,CIK

12、細胞較PBMC變大,臺盼蘭拒染實驗檢測細胞活力均>90％,兩組無明顯差異。在培養(yǎng)的第14天,OKT3:UCHT1增殖倍數(shù)分別達到470.94:33.73(P<0.05)。分別于培養(yǎng)的0天、14天應用流式細胞儀對兩組細胞進行分析比較:0天時,CD3+CD8+細胞比例為(28.82±13.36)％,OKT3組升至(74.94±11.45)％,UCHT1組升至(47.27±29.38)％,兩組比較P<0.05。0天時,CD56+細胞比例為(2

13、7.17±9.32)％,第14天時,OKT3組降至(16.24±13.96)％,而UCHT1組升至(38.91±25.23)％,兩組比較P<0.05。選取3例行對K562的細胞毒性試驗,當效靶比分別為20:1,OKT3、UCHT1比較為(5.01±8.69)％:(44.65±20.14)％,P=0.078。
　　 3.體外應用PAA、RPMI1640及AIM V培養(yǎng)基體外培養(yǎng)DC,三種培養(yǎng)基誘導的不成熟DC(immature d

14、endritic cells,iDC)形態(tài):1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC為半貼壁狀態(tài),細胞圓而透亮,表面具細小突起,大部分為單個,少數(shù)聚集成簇。而PAA培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC細胞伸長貼壁:AIMV培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC形狀各異,大部分貼壁,細胞呈梭形,胞質向外延伸。促成熟后,流式細胞儀檢測顯示:三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC純度均達到80％以上。在誘導成熟后,三種培養(yǎng)基對DC表達HLA-DR、CD80、CD83、CD86分子的平均熒光強度平均值分別為:RPMI1

15、640:294.93±104.06、229.47±50.98、273.15±169.05、93.66±26.67；AIM V:289.55±72.65、169.65±42.25、180.65±45.60、302.86±52.74;PAA:298.31±116.60、132.18±15.02、175.57±91.48、142.36±17.57。
　　 4.采用不同促成熟方案(cocktail、TNF-α)刺激DC細胞,流式細胞儀檢

16、測HLA-DR、CD80、CD83、CD86的平均熒光強度平均值:cocktail:294.93±104.06、229.47±50.98、273.15±169.05、93.66±26.67。TNF-α:290.18±57.38、130.07±25.49、91.33±4.86、83.97±28.77。
　　 5.分別采用含2％自體血漿、10％自體血漿、2％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、10％FBS的RP

17、MI1640完全培養(yǎng)基體外培養(yǎng)DC細胞,流式細胞儀檢測HLA-DR、CD80、CD83、CD86的平均熒光強度平均值,2％自體血漿分別為407.60±130.12、139.67±84.13、177.71±37.59、199.60±86.91；10％自體血漿分別為377.10±60.00、134.18±81.25、127.25±20.61、179.66±64.85；2％FBS:262.15±84.16、207.28±41.56、196.2

18、1±91.58、132.75±42.80；10％FBS:294.93±104.06、229.47±50.98、273.15±169.05、93.66±26.67。
　　 6.DC與CIK共培養(yǎng):DC體外培養(yǎng)第6天,加入HBcAg,孵育24小時,之后加入cocktail促成熟,24小時后與自體CIK細胞共孵育,mDC與CIK細胞比例為1:10。mDC-CIK與CIK細胞增殖比較,共孵育三天后,mDC-CIK細胞增殖倍數(shù)為3.99±

19、1.75倍,而未加入DC的CIK細胞增殖倍數(shù)為3.25±1.75倍,兩組比較有顯著性差異(P=0.007)。mDC-CIK混合培養(yǎng)的第14天及CIK培養(yǎng)的第22天,流式細胞儀檢測擴增的細胞亞群的變化:CD3+、CD56+、CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+細胞百分比均無顯著性差異。五聚體檢測針對HBcAg18～27V細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell CTL),PBMC、mDC-CIK、CIK分別為:0.16

20、％、1.98％、2.21％；HBcAg18～27I特異性CTL,PBMC、mDC-CIK、CIK分別為:0.17％、1.67％、1.95％。
　　 結論:
　　 1.在僅加入1％自體血漿的情況下,AIM V及OpTmizer均能較好的擴增CIK細胞,而不加自體血漿擴增效率明顯下降甚至擴增失敗。在體外培養(yǎng)的第14天,兩種培養(yǎng)基擴增CD3+CD56+細胞頻數(shù)相似,但opTmizer培養(yǎng)的CIK細胞的絕對數(shù)量明顯高于AIM V

21、,這說明了OpTmirer較AIM V更能誘導出大量的CD3+CD56+細胞。而且評估兩種培養(yǎng)條件下CIK細胞對K562的殺傷效果是相似的,這進一步提示了OpTmizer更適合體外誘導培養(yǎng)CIK細胞。
　　 2.研究發(fā)現(xiàn)應用不同亞型的抗CD3單克隆抗體誘導的CIK細胞,流式細胞儀檢測細胞大小,可見細胞體積較PBMC明顯增大,表明兩種抗CD3單克隆抗體均可使細胞活化增殖。OKT3擴增CIK細胞總數(shù)明顯高于UCHT1,其主要成為CD

22、3+CD8+細胞,而相對CD56+細胞的比例較低。通過細胞毒試驗,我們發(fā)現(xiàn)UCHT1的殺傷效果較OKT3組增強,這提示了CIK細胞中高比例的CD56+細胞可能較CD3+CD8+對于殺傷腫瘤細胞更加重要。
　　 3.AIM V、PAA及RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC細胞,促成熟后,細胞表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表達均明顯升高,AIM V及RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC細胞,促成熟后,細胞表面分子HLA

23、-DR、CD80、CD83、CD86的表達均明顯升高,但AIM V培養(yǎng)的DC在未成熟狀態(tài)低表達CD80、CD83,而成熟時則高表達上述分子,表明:AIM V培養(yǎng)的DC可以保持較好的未成熟及成熟狀態(tài),因此采用AIM V培養(yǎng)基更加適合體外培養(yǎng)DC。
　　 4.在本實驗中,流式細胞儀檢測顯示:DC誘導活化后,CD83、CD80、CD86和MHCⅡ分子HLA-DR都有上調。盡管數(shù)據(jù)顯示TNF-a在一定程度上能夠活化DC,但Cocktai

24、l法活化DC的表面分子表達更高一些。特別是DC的特異性成熟標記CD83的表達,Cocktail組顯著高于TNF-a組,而且HLA-DR、CD80、CD83、CD86的MFI值,cocktail亦均高于TNF-α組,而且表面分子的共表達,Cocktail組顯著高于TNF-a組,表明Cocktail活化方案更能夠有效地誘導DC成熟。
　　 5.本實驗提示:2％自體血漿、10％自體血漿、2％FBS、10％FBS培養(yǎng)DC的方案均能用于培

25、養(yǎng)DC細胞,并且誘導生成的DC能被Cocktail誘導活化,雖然應用自體血漿可以使CD86分子表達高于FBS,CD80分子表達低于FBS,但沒有統(tǒng)計學差異。在今后的臨床應用過程中可以考慮應用少量自體血漿培養(yǎng)DC細胞,避免宿主對異種血清感染或過敏的風險。
　　 6.DC與CIK共培養(yǎng),初步研究結果表明:mDC可以刺激CIK細胞增殖,但對增殖的細胞亞群沒有明顯影響。五聚體檢測的兩例無癥狀HBsAg攜帶者HBcAg18～27V及HBc