沉默供體肝臟內(nèi)RPS3基因減輕大鼠移植肝臟I-RI.pdf

1、目的：核轉(zhuǎn)錄因子KappaB(NF-κB)是在上世紀(jì)八十年代發(fā)現(xiàn)的一種能夠與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合，并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)復(fù)合體。它與細(xì)胞中的絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)密切相關(guān)，尤其是在肝移植后早期就發(fā)生的缺血再灌注損傷中，NF-κB起著舉足輕重的作用。核糖體蛋白S3(ribosomal protein S3，RPS3)最初被認(rèn)為是核糖體的亞單位，參與蛋白質(zhì)翻譯。近年發(fā)現(xiàn)，它是NF-κB復(fù)合體的必需功能亞單位，在NF-κB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄過程中

2、具有關(guān)鍵性作用，這有可能成為NF-κB信號(hào)通路中又一突破性認(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)擬采用RNA干擾技術(shù)沉默供體肝臟內(nèi)RPS3基因的表達(dá)，觀察其對(duì)NF-κB活性及表達(dá)量的影響，以及對(duì)肝移植后早期缺血再灌注損傷(I/RI)的保護(hù)作用，探討RPS3在肝移植后早期I/RI中的作用機(jī)制。
　　 方法：構(gòu)建以腺病毒(Ad)為載體的RPS3基因特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)顆粒。將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，采用改良的Kamada袖套法于各組建立

3、大鼠原位肝移植動(dòng)物模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為三組：(1) RPS3基因特異性短發(fā)夾RNA處理組(Ad-RPS3-shRNA)、(2)空白腺病毒對(duì)照組(Ad-blank-control)、(3)生理鹽水對(duì)照組(NS-control)。于肝移植前48h分別用目標(biāo)病毒表達(dá)顆粒、空白腺病毒載體、生理鹽水經(jīng)門靜脈灌注三組供體大鼠肝臟：建立肝移植模型，后于肝臟恢復(fù)灌注3h、12h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死受體大鼠6只。經(jīng)上腔靜脈收集血液標(biāo)本及相同部位肝臟組織標(biāo)

4、本備用。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST水平；光鏡下雙盲法以Suzuki評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各肝臟組織病理改變?cè)u(píng)分；ELISA法檢測(cè)各標(biāo)本血漿炎癥因子TNF-α、IL-iβ、ICAM-1水平；qRT-PCR法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-iβ、ICAM-1、RPS3 mRNA水平；Western blot法檢測(cè)肝臟組織中NF-κB蛋白水平；EMSA法檢測(cè)肝臟組織中NF-κB蛋白活性。
　　 結(jié)果：肝功指標(biāo)：肝移植恢復(fù)灌注3

5、h、12h Ad-RPS3-shRNA組ALT、AST(725.9±67.3 U/L,1842.7±176.6 U/L；863.7±72.7 U/L,1513.4±187.6 U/L)顯著低于Ad-blank-control組(1736.5±173.7 U/L，3232.6±273.1 U/L；1874.6±163.7 U/L,3149.1±282.6 U/L)與NS-control組(1472.2±178.4 U/L,3347.6±2

6、93.5 U/L；2109.3±188.7 U/L,3662.4±269.6 U/L)，并且與這兩組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；Adblank-control組與NS-control組間無顯著差異(P＞0.05)。肝臟組織病理改變?cè)u(píng)分：恢復(fù)灌注3h、12h Ad-RPS3-shRNA組Suzuki評(píng)分(3.72±0.31，3.94±0.34)均低于Ad-blank-control組(7.93±0.63，8.18±0.66)與

7、NS-control組(8.22±0.61，8.25±0.69)，并且有顯著差異(P＜0.01)；Ad-blank-control組與NS-control組間無顯著差異(P＞0.05)。血漿炎癥因子水平、肝臟組織炎癥因子及RPS3 mRNA水平以及NF-κB蛋白表達(dá)量和活性，在肝臟移植后恢復(fù)灌注3h、12h，同前面兩個(gè)檢測(cè)指標(biāo)具有相似的變化傾向。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了通過門靜脈灌注攜帶目標(biāo)基因shRNA的慢病毒載體，可以達(dá)到