大鼠肝臟移植后急性移植物抗宿主疾病模型構(gòu)建及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、前言： 肝臟移植(liver transplantation，LT)目前已經(jīng)成為治療終末期肝病的唯一有效方法，多年來的研究重點(diǎn)一直是如何控制排斥反應(yīng)和最終獲得免疫耐受，卻忽略了移植物抗宿主疾病(graft versus host disease，GVHD)的臨床意義和研究。自1988年Burdick等報(bào)道了全球第一例肝臟移植后急性移植物抗宿主疾病(aGVHD following fiver transplantation/liv

2、er transplantation associated aGVHD，LTx-aGVI-ID)以來，相關(guān)報(bào)道逐漸增多，今已達(dá)約80例。根據(jù)國(guó)際上幾個(gè)著名肝臟移植中心統(tǒng)計(jì)報(bào)道，其發(fā)病率雖然為1-2％，因LTx-aGVHD無特異性I臨床癥狀、對(duì)其發(fā)生發(fā)展機(jī)制認(rèn)識(shí)不足和缺乏有效的診斷治療手段，發(fā)病后死亡率高達(dá)80％-100％，故已引起了肝臟移植領(lǐng)域?qū)＜覀兊闹匾暋?材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組以Lewis大鼠作為供體，Le

3、wis或(LewisXBN)F1大鼠作為受體，根據(jù)肝臟移植及輸入供體源脾臟細(xì)胞的數(shù)量分以下各組： (1)半同種異源大鼠肝臟移植組(semiallogeneic liver transplantation groups，Semi-LT groups)：以Lewis大鼠作為供體、(LewisXBN)F1大鼠作為受體，依據(jù)肝臟移植同時(shí)輸入新鮮制備的供體源脾臟細(xì)胞數(shù)量的不同(0、1X108、2X108、3X108和4X108)分為5個(gè)亞

4、組。 (2)同種同基因大鼠肝臟移植組(syngeneic liver transplantation group，sLT group)：以Lewis大鼠作為供體和受體，肝臟移植后僅輸入不含脾臟細(xì)胞的RPMI-1640液2ml。 (3)半同種異源大鼠脾臟細(xì)胞移植組(semiallogeneic splenocyte transplantation groups，Semi-ST groups)：以Lewis大鼠作為供體，(L

5、ewisXBN)F1大鼠作為受體，依據(jù)輸入新鮮制備的供體源脾臟細(xì)胞數(shù)量的不同(1X108、2X108、3X108和4X108)分為4個(gè)亞組。每亞組取6-8只受體，觀察移植術(shù)后至100天，記錄每只大鼠的存活時(shí)間和aGVHD發(fā)生情況，完成生存率的分析和比較。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體需要選擇其中部分亞組進(jìn)一步研究其相關(guān)的發(fā)生機(jī)制。 二、aGVHD的檢測(cè)術(shù)后隔日觀測(cè)aGVHD相關(guān)大體表現(xiàn)如皮炎、脫毛、腹瀉、弓背等現(xiàn)象。在動(dòng)物死亡時(shí)或移植術(shù)后16

6、天犧牲動(dòng)物留取皮膚、大腸、小腸、肝臟組織標(biāo)本，常規(guī)固定、染色后光鏡下觀察aGVHD相關(guān)病理表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)分析各組受體aGVHD的發(fā)生率、生存時(shí)間。 三、外周血WBC、HGB、PLT檢測(cè)及血清ALT、AST的檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)留取外周血標(biāo)本以全自動(dòng)分析儀進(jìn)行全血WBC、HGB、PLT和血清ALT、AST測(cè)定，以反映移植術(shù)后骨髓造血系統(tǒng)和肝臟受累情況。 四、血清TH1/TH2類細(xì)胞因子含量檢測(cè)血清IL-2、IFN-Y和TGF-β1含量

7、應(yīng)用ELISA法檢測(cè)。 五、外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)外周血血細(xì)胞梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例。 六、外周血單個(gè)核細(xì)胞中受體嵌合率檢測(cè)選擇雄性Lewis大鼠為供體，雌性Lewis和(LewisXBN)F1大鼠作為受體。肝臟移植術(shù)后以Real-Time PCR方法檢測(cè)受體中供體特有的基因(Y-染色體)的量及其與管家基因的比例來計(jì)算嵌合率。

8、 結(jié)果： 一、大鼠肝臟移植后急性移植物抗宿主疾病模型的構(gòu)建以Lewis大鼠為供體、(LewisXBN)F1大鼠作為受體，單純肝臟移植后受體的生存情況與同種同基因大鼠肝臟移植組相似，均獲得長(zhǎng)期存活(>100天)無aGVHD發(fā)生。肝臟移植同時(shí)輸入供體源脾臟細(xì)胞可以誘導(dǎo)LTx-aGVHD的發(fā)生，aGVHD的發(fā)生率隨輸入脾臟細(xì)胞數(shù)量的增加而增加。肝臟移植同時(shí)輸入1X108個(gè)供體源脾臟細(xì)胞后，致死性aGVHD的發(fā)生率為16.7％(1/6)

9、。將輸入供體源脾臟細(xì)胞數(shù)量增加至2X108、3X108、4X108，致死性aGVHD的發(fā)生率分別達(dá)50％(3/6)、83.3％(5/6)和100％(8/8)。而僅分別輸入1X108、2X108、3X108、4X108供體源脾臟細(xì)胞后， aGVHD的發(fā)生率較低，分別為0(0/6)、16.7％(1，6)、16.7％(1/6)和50％(3/6)。在半同種異源大鼠肝臟移植組中，(LewisXBN)F1受體大鼠肝臟移植后發(fā)生aGVHD的大體表現(xiàn)與

10、半同種異源大鼠脾臟細(xì)胞移植組相似，均表現(xiàn)出體重下降、皮疹、脫毛、腹瀉、弓背等典型表現(xiàn)。通過病理、外周血血細(xì)胞和肝臟功能分析，半同種異源大鼠脾臟細(xì)胞移植組中肝臟、皮膚、小腸和骨髓造血系統(tǒng)是主要受累靶器官。而在半同種異源大鼠肝臟移植組中主要受累的靶器官主要為皮膚、小腸和骨髓造血系統(tǒng)，移植肝臟無明顯受累。 二、肝臟移植后急性移植物抗宿主疾病的發(fā)生機(jī)制及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作用的初步研究同種同基因大鼠肝臟移植后外周血血清中IL

11、-2和IFN-γ水平出現(xiàn)一過性升高，TGF-β1含量出現(xiàn)暫時(shí)性下降，隨術(shù)后時(shí)間推移均逐漸恢復(fù)至正常大鼠水平。而外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)保持平穩(wěn)與正常大鼠相似無明顯差異。在半同種異源大鼠肝臟移植組，發(fā)生aGVHD的(LewisXBN)F1受體大鼠外周血血清中IL-2和IFN-γ水平逐漸升高，在術(shù)后第4天與同種同基因大鼠肝臟移植組之間并無明顯差異(P>0.05)，而術(shù)后8、12、16天明顯高于

12、同種同基因大鼠肝臟移植組(P<0.05)。外周血血清TGF-β1含量、單個(gè)核淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例隨aGVHD的發(fā)生逐漸降低，至術(shù)后12、16天明顯低于正常大鼠和同種同基因大鼠肝臟移植組(P<0.05)。在未發(fā)生aGVHD的受體大鼠中，外周血血清中IL-2和IFN-γ水平與同種同基因大鼠肝臟移植組相比無明顯差異，TGF-β1含量、單個(gè)核淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例逐漸升高，在術(shù)后第12、16天明

13、顯高于與同種同基因大鼠肝臟移植組(P<0.05)。 三、肝臟移植后急性移植物抗宿主疾病中外周血嵌合體變化分析同種同基因大鼠肝臟移植組術(shù)后外周血中術(shù)后早期可檢測(cè)出明顯嵌合現(xiàn)象(第4天的嵌合率為1.37％±0.37％)。隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，外周血中嵌合率迅速下降至術(shù)后第50天僅有微弱的嵌合體檢測(cè)出(嵌合率為0.02％±0.02％)，至術(shù)后第100天則無明顯嵌合體檢測(cè)出。半同種異源大鼠肝臟移植組中，未發(fā)生aGVHD受體外周血中嵌合率變

14、化趨勢(shì)均與同種同基因大鼠肝臟移植組相似。發(fā)生aGVHD受體中，外周血中嵌合體在術(shù)后第4、8、12和16天呈現(xiàn)快速升高趨勢(shì)，并在術(shù)后早期(術(shù)后第4天)即明顯高于同種同基因大鼠肝臟移植組和半同種異源大鼠肝臟移植組中未發(fā)生aGVHD的受體(P<0.05)。 結(jié)論： 一、以Lewis大鼠為供體、(LewisXBN)F1大鼠為受體，在供受體間形成以供體為主導(dǎo)的供受體間MHC單體單向相合現(xiàn)象時(shí)，通過肝臟移植同時(shí)輸入一定數(shù)量的供體源脾

15、臟細(xì)胞可以成功建立大鼠LTx-aGVHD模型； 二、在所建立的大鼠LTx-aGVHD模型中，受體內(nèi)存在TH1/TH2類細(xì)胞因子代謝紊亂，表現(xiàn)為IL-2和IFN-γ等TH1類細(xì)胞因子水平的升高和TGF-β1等TH2類細(xì)胞因子水平的降低，而肝臟移植手術(shù)本身對(duì)受體的損傷是導(dǎo)致術(shù)后早期受體內(nèi)TH1/TH2類細(xì)胞因子代謝紊亂的主要原因，可能對(duì)LTx-aGVHD的發(fā)生有促進(jìn)作用； 三、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能具有抑制LTx