大鼠部分肝移植肝動脈化模型的建立及小移植物早期損傷機制的初步研究.pdf

1、第一部分大鼠部分肝移植肝動脈化模型的研究　　目的：建立大鼠部分肝移植的肝動脈重建動物模型，并研究肝動脈重建對大鼠部分肝移植后肝功能、肝再生的意義。 方法：SD大鼠行切除左外葉和乳頭葉的原位部分二袖套法肝移植，分為未行肝動脈重建(POLT組，n=24)和肝動脈重建(APOLT組，n=24)，分別于術后第1、2、4和7天處死后查肝功能、組織學檢查及流式細胞儀檢測移植肝增殖活性。 結(jié)果：肝功能檢查ALT和TB值術后第1天2組

2、即開始明顯增高，以后逐漸降低，第4天ALT和TB值POLT組均高于APOLT組，差異有顯著性(P＜0.05)；組織學檢查術后APOLT組與POLT組相比可見更多的二倍體和多倍體肝細胞(P＜0.05)；第2天和第4天APOLT組增殖指數(shù)分別為33.81±3.45％和35.33±2.52％較POLT組23.08±4.66％和29.79±1.81％明顯增高，差異有顯著性(P＜0.01)。 結(jié)論：本研究結(jié)果初步表明肝動脈吻合可明顯改善大

3、鼠部分肝移植移植肝的功能，減輕移植肝的組織學改變，促進部分移植肝的再生。 第二部分大鼠部分肝移植模型早期損傷機制的研究 目的：建立大鼠部分肝移植肝動脈化模型的基礎上，以全肝移植模型和不吻合肝動脈的部分肝移植模型為對照，對部分肝移植后移植物早期損傷的機制以及肝動脈化在小移植物損傷中的地位和作用進行初步研究。 方法：選取雄性SD大鼠，隨機分成4組：①假手術組(A組)；②全肝移植組(B組)；③部分肝移植肝動脈化模型組

4、(C組)；④部分肝移植組(D組)。在恢復血供后30min，2h，3h，6h，12h，24h等6個時間點分別取材、送檢。主要檢測指標：1、肝功能指標檢測。2、肝組織病理組織學檢查和透射電鏡檢查。3、檢測血清標本TNF-α的表達。4、檢測肝組織標本NF-KappaB亞基(P55和P65蛋白)的表達。5、原位末端標記法(TUNEL)檢測凋亡。6、熒光半定量RT-PCR檢測ICAM-1、TNF-α和TNF-α受體在肝組織中的表達。7、提取核蛋白

5、，采用電泳遷移率改變法測定NF-κB的結(jié)合活性。8、所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(M±SD)表示，用SPSS軟件包(11.5版)進行統(tǒng)計學處理，均數(shù)的比較采用t檢驗，率的比較采用x2檢驗。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。 結(jié)果：1、肝功能：A組(假手術組)TB、ALT和AST值顯著低于其余3組(P＜O.05)；TB、ALT和AST峰值均出現(xiàn)在術后6h和12h后逐漸下降；TB、ALT和AST峰值依次為D組＞C組＞B組(P均

6、＜0.05)。2、B、C和D3組均可見到典型移植肝缺血再灌注損傷改變。其中以6h時間點損傷最重，24h時間點組織水腫、肝竇充血已經(jīng)明顯減輕。電鏡見B、C、D組細胞腫脹破壞明顯，線粒體嵴斷裂、消失，染色質(zhì)邊集明顯或者核溶解消失，可見到典型的凋亡肝細胞。3、再灌注后B、C和D組肝組織P50蛋白和P65蛋白表達顯著升高，在2h和3h時達到峰值，隨后明顯下降；至12h～24h，P50接近對照組水平，而P65仍顯著高于對照組。峰值D組＞C組＞B組

7、，其中D組峰值顯著高于B組和C組，而B、C組峰值沒有顯著差異。P50和P65在24h，6個時間點的血清水平變化趨勢相似，P65維持時間較P50長。4、再灌注后B、C和D組血清TNF-α表達水平顯著升高，在3h時達到峰值，隨后逐漸下降；至12h～24h，仍維持遠高于對照組的水平。峰值D組＞C組＞B組，其中D組峰值顯著高于B和C組，而B、C組峰值沒有顯著差異。5、D組(部分肝移植組)各時間點細胞凋亡數(shù)均顯著多于B組(全肝移植組)和C組(部分

8、肝移植肝動脈化組)。B組和C組相比也有顯著性差異。各組細胞凋亡以術后6h最重。6、對照組(A組)為陰性表達；TNF-α擴增片段長241bp，-actin擴增片段長為331bp。D組峰值位于2h，B、C組峰值位于3h，但與2h點mRNA水平接近；6h后顯著下降，B、C組12h和24h為陰性表達，D組12h表達顯著減少，24h點為陰性表達。ICAM-1基因產(chǎn)物長度為570bp，TNF-α受體2基因產(chǎn)物長度為240bp。對照組(A組)為陰性表

9、達，在B、C、D組均檢出目的基因擴增產(chǎn)物陽性表達，D組表達水平顯著高于B、C組。7、A組肝組織中NF-KappaB的活性很弱，呈陰性表現(xiàn)。B、C、D三組NF-KappaB變化趨勢相仿，一般在恢復灌注后即活化，0.5h時間點開始檢出；峰值出現(xiàn)在2h和3h，至6h已明顯消退；D組的活化峰值強度高于B、C組，NF-KappaB活化維持時間較B、C組明顯延長，至12h仍可以檢出。 結(jié)論：1、不吻合肝動脈的大鼠部分肝移植模型的小移植物在移

10、植術后早期存在比全肝移植、吻合肝動脈的部分肝移植模型的移植物更為嚴重的缺血再灌注損傷。這種損傷以肝細胞功能改變及大量肝細胞凋亡為特點。 3、NF-κB、TNF-α、ICAM-1的表達強度與肝臟損傷程度有密切關系，可能是移植物損傷的主要分子機制。移植肝內(nèi)NF-κB的高表達可能是移植肝缺血再灌注損傷發(fā)生的重要始動環(huán)節(jié)之一。移植肝發(fā)生缺血再灌注損傷，胞漿內(nèi)I-kappaB降解，NF-kappaB游離并進入細胞核內(nèi)，與一些炎癥因子基因啟

11、動子區(qū)域特異性序列結(jié)合，上調(diào)TNFα、ICAM-1mRNA表達，從而引起肝臟缺血再灌注損傷。這可能揭示了NF-kappaB/I-kappaB傳導通路在肝臟缺血再灌注損傷中的作用機制。 第三部分iNOS在大鼠部分肝移植早期損傷中的表達及意義 目的：建立大鼠部分肝移植模型，對誘導性一氧化氮合成酶(iNOS)在大鼠肝移植小移植物早期損傷中的表達及意義進行研究。 方法：選取雄性SD大鼠，隨機分成3組：假手術組(正常對照

12、組，A組)；缺血再灌注損傷組(B組)；小移植物組(C組)。比較各組肝功能指標變化、肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的濃度、肝臟組織病理組織學和透射電鏡改變、RT-PCR檢測iNOS在肝組織中的表達。 結(jié)果：A組肝功能指標顯著低于其余2組；肝功能指標峰值均出現(xiàn)在術后6h，12h后逐漸下降；肝功能指標峰值依次為C組＞B組＞A組(P＜0.05)。A組MDA顯著低于其余2組，肝臟MDA濃度C組＞B組＞A組(P