大鼠部分肝移植肝動(dòng)脈化模型的建立及小移植物早期損傷機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分大鼠部分肝移植肝動(dòng)脈化模型的研究　　目的：建立大鼠部分肝移植的肝動(dòng)脈重建動(dòng)物模型，并研究肝動(dòng)脈重建對(duì)大鼠部分肝移植后肝功能、肝再生的意義。 方法：SD大鼠行切除左外葉和乳頭葉的原位部分二袖套法肝移植，分為未行肝動(dòng)脈重建(POLT組，n=24)和肝動(dòng)脈重建(APOLT組，n=24)，分別于術(shù)后第1、2、4和7天處死后查肝功能、組織學(xué)檢查及流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植肝增殖活性。 結(jié)果：肝功能檢查ALT和TB值術(shù)后第1天2組

2、即開始明顯增高，以后逐漸降低，第4天ALT和TB值POLT組均高于APOLT組，差異有顯著性(P＜0.05)；組織學(xué)檢查術(shù)后APOLT組與POLT組相比可見更多的二倍體和多倍體肝細(xì)胞(P＜0.05)；第2天和第4天APOLT組增殖指數(shù)分別為33.81±3.45％和35.33±2.52％較POLT組23.08±4.66％和29.79±1.81％明顯增高，差異有顯著性(P＜0.01)。 結(jié)論：本研究結(jié)果初步表明肝動(dòng)脈吻合可明顯改善大

3、鼠部分肝移植移植肝的功能，減輕移植肝的組織學(xué)改變，促進(jìn)部分移植肝的再生。 第二部分大鼠部分肝移植模型早期損傷機(jī)制的研究 目的：建立大鼠部分肝移植肝動(dòng)脈化模型的基礎(chǔ)上，以全肝移植模型和不吻合肝動(dòng)脈的部分肝移植模型為對(duì)照，對(duì)部分肝移植后移植物早期損傷的機(jī)制以及肝動(dòng)脈化在小移植物損傷中的地位和作用進(jìn)行初步研究。 方法：選取雄性SD大鼠，隨機(jī)分成4組：①假手術(shù)組(A組)；②全肝移植組(B組)；③部分肝移植肝動(dòng)脈化模型組

4、(C組)；④部分肝移植組(D組)。在恢復(fù)血供后30min，2h，3h，6h，12h，24h等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取材、送檢。主要檢測(cè)指標(biāo)：1、肝功能指標(biāo)檢測(cè)。2、肝組織病理組織學(xué)檢查和透射電鏡檢查。3、檢測(cè)血清標(biāo)本TNF-α的表達(dá)。4、檢測(cè)肝組織標(biāo)本NF-KappaB亞基(P55和P65蛋白)的表達(dá)。5、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡。6、熒光半定量RT-PCR檢測(cè)ICAM-1、TNF-α和TNF-α受體在肝組織中的表達(dá)。7、提取核蛋白

5、，采用電泳遷移率改變法測(cè)定NF-κB的結(jié)合活性。8、所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，用SPSS軟件包(11.5版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用x2檢驗(yàn)。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。 結(jié)果：1、肝功能：A組(假手術(shù)組)TB、ALT和AST值顯著低于其余3組(P＜O.05)；TB、ALT和AST峰值均出現(xiàn)在術(shù)后6h和12h后逐漸下降；TB、ALT和AST峰值依次為D組＞C組＞B組(P均

6、＜0.05)。2、B、C和D3組均可見到典型移植肝缺血再灌注損傷改變。其中以6h時(shí)間點(diǎn)損傷最重，24h時(shí)間點(diǎn)組織水腫、肝竇充血已經(jīng)明顯減輕。電鏡見B、C、D組細(xì)胞腫脹破壞明顯，線粒體嵴斷裂、消失，染色質(zhì)邊集明顯或者核溶解消失，可見到典型的凋亡肝細(xì)胞。3、再灌注后B、C和D組肝組織P50蛋白和P65蛋白表達(dá)顯著升高，在2h和3h時(shí)達(dá)到峰值，隨后明顯下降；至12h～24h，P50接近對(duì)照組水平，而P65仍顯著高于對(duì)照組。峰值D組＞C組＞B組

7、，其中D組峰值顯著高于B組和C組，而B、C組峰值沒(méi)有顯著差異。P50和P65在24h，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清水平變化趨勢(shì)相似，P65維持時(shí)間較P50長(zhǎng)。4、再灌注后B、C和D組血清TNF-α表達(dá)水平顯著升高，在3h時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；至12h～24h，仍維持遠(yuǎn)高于對(duì)照組的水平。峰值D組＞C組＞B組，其中D組峰值顯著高于B和C組，而B、C組峰值沒(méi)有顯著差異。5、D組(部分肝移植組)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著多于B組(全肝移植組)和C組(部分

8、肝移植肝動(dòng)脈化組)。B組和C組相比也有顯著性差異。各組細(xì)胞凋亡以術(shù)后6h最重。6、對(duì)照組(A組)為陰性表達(dá)；TNF-α擴(kuò)增片段長(zhǎng)241bp，-actin擴(kuò)增片段長(zhǎng)為331bp。D組峰值位于2h，B、C組峰值位于3h，但與2h點(diǎn)mRNA水平接近；6h后顯著下降，B、C組12h和24h為陰性表達(dá)，D組12h表達(dá)顯著減少，24h點(diǎn)為陰性表達(dá)。ICAM-1基因產(chǎn)物長(zhǎng)度為570bp，TNF-α受體2基因產(chǎn)物長(zhǎng)度為240bp。對(duì)照組(A組)為陰性表

9、達(dá)，在B、C、D組均檢出目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物陽(yáng)性表達(dá)，D組表達(dá)水平顯著高于B、C組。7、A組肝組織中NF-KappaB的活性很弱，呈陰性表現(xiàn)。B、C、D三組NF-KappaB變化趨勢(shì)相仿，一般在恢復(fù)灌注后即活化，0.5h時(shí)間點(diǎn)開始檢出；峰值出現(xiàn)在2h和3h，至6h已明顯消退；D組的活化峰值強(qiáng)度高于B、C組，NF-KappaB活化維持時(shí)間較B、C組明顯延長(zhǎng)，至12h仍可以檢出。 結(jié)論：1、不吻合肝動(dòng)脈的大鼠部分肝移植模型的小移植物在移

10、植術(shù)后早期存在比全肝移植、吻合肝動(dòng)脈的部分肝移植模型的移植物更為嚴(yán)重的缺血再灌注損傷。這種損傷以肝細(xì)胞功能改變及大量肝細(xì)胞凋亡為特點(diǎn)。 3、NF-κB、TNF-α、ICAM-1的表達(dá)強(qiáng)度與肝臟損傷程度有密切關(guān)系，可能是移植物損傷的主要分子機(jī)制。移植肝內(nèi)NF-κB的高表達(dá)可能是移植肝缺血再灌注損傷發(fā)生的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)之一。移植肝發(fā)生缺血再灌注損傷，胞漿內(nèi)I-kappaB降解，NF-kappaB游離并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與一些炎癥因子基因啟

11、動(dòng)子區(qū)域特異性序列結(jié)合，上調(diào)TNFα、ICAM-1mRNA表達(dá)，從而引起肝臟缺血再灌注損傷。這可能揭示了NF-kappaB/I-kappaB傳導(dǎo)通路在肝臟缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。 第三部分iNOS在大鼠部分肝移植早期損傷中的表達(dá)及意義 目的：建立大鼠部分肝移植模型，對(duì)誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)在大鼠肝移植小移植物早期損傷中的表達(dá)及意義進(jìn)行研究。 方法：選取雄性SD大鼠，隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(正常對(duì)照

12、組，A組)；缺血再灌注損傷組(B組)；小移植物組(C組)。比較各組肝功能指標(biāo)變化、肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的濃度、肝臟組織病理組織學(xué)和透射電鏡改變、RT-PCR檢測(cè)iNOS在肝組織中的表達(dá)。 結(jié)果：A組肝功能指標(biāo)顯著低于其余2組；肝功能指標(biāo)峰值均出現(xiàn)在術(shù)后6h，12h后逐漸下降；肝功能指標(biāo)峰值依次為C組＞B組＞A組(P＜0.05)。A組MDA顯著低于其余2組，肝臟MDA濃度C組＞B組＞A組(P