雙靶標(biāo)Real-time PCR檢測(cè)血清DNA用于日本血吸蟲(chóng)感染宿主短期療效考核及哨鼠預(yù)警的研究.pdf

1、第一部分雙靶標(biāo)Real-time PCR法對(duì)日本血吸蟲(chóng)病家兔模型不同病期血清DNA的短期療效考核
　　目的：應(yīng)用雙靶標(biāo)Real-time PCR法檢測(cè)感染宿主不同病期吡喹酮治療后血清DNA的動(dòng)態(tài)變化，探索和評(píng)價(jià)以蟲(chóng)體DNA轉(zhuǎn)陰作為療效考核的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，用于短期療效考核的潛在價(jià)值。
　　方法：建立日本血吸蟲(chóng)病家兔模型，除對(duì)照組家兔外，分別在感染后4w、7w、12w和16w按200㎎/㎏體重的劑量給予實(shí)驗(yàn)組家兔吡喹酮治療（隔一周加

2、強(qiáng)治療一次）。于治療后1-7 d（每天）、第2 w至處死（每周），與對(duì)照組家兔同步收集血清。抽提血清DNA，以雙靶標(biāo)Real-time PCR法進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：雙靶標(biāo)Real-time PCR法均可在感染后3d的血清模板中檢測(cè)到陽(yáng)性產(chǎn)物。雙靶標(biāo)Real-time PCR法在家兔感染后3d～42w的血清中均可檢測(cè)出陽(yáng)性DNA；對(duì)不同病期治療后血清DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，SjR2-QPCR和Sj19-QPCR檢測(cè)的血清 DNA峰值均

3、出現(xiàn)在治療后3d-4d，兩種靶標(biāo)在感染后4w、7w、12w、16w治療組血清DNA的轉(zhuǎn)陰時(shí)間分別為治療后的6w-7w、15w-16w、18w-20w和26w-28w。在雙性感染治療后宿主血清蟲(chóng)體DNA轉(zhuǎn)陰拐點(diǎn)的研究中，ROC分析提示，感染家兔均在治療后2w左右蟲(chóng)體DNA呈轉(zhuǎn)陰趨勢(shì)。
　　結(jié)論：Real-time PCR法對(duì)于日本血吸蟲(chóng)病具有早期診斷價(jià)值。兩種靶標(biāo)的QPCR定量檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種靶標(biāo)均具有較高的敏感性且兩者存在一定的

4、互補(bǔ)性。前期研究顯示，在感染宿主中血吸蟲(chóng)血清 DNA來(lái)源于蟲(chóng)體和蟲(chóng)卵，通過(guò)定量檢測(cè)血清DNA結(jié)果顯示，兩種靶標(biāo)對(duì)不同病期治療后血清DNA的轉(zhuǎn)陰時(shí)間從6w-7w至26w-28w不等，而如依據(jù)血清中血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體DNA的變化規(guī)律，經(jīng)ROC分析推測(cè)蟲(chóng)體 DNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間節(jié)點(diǎn)，可大大縮短療效考核時(shí)間。本研究結(jié)果為探索以治療后血清蟲(chóng)體 DNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間節(jié)點(diǎn)作為短期療效考核的潛在應(yīng)用價(jià)值，提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第二部分雙靶標(biāo)巢式PCR法在日本血吸蟲(chóng)哨

5、鼠預(yù)警模型中的應(yīng)用研究
　　目的：將雙靶標(biāo)巢式PCR法用于日本血吸蟲(chóng)哨鼠預(yù)警，探索該方法的靈敏性，評(píng)價(jià)其對(duì)早期預(yù)警的價(jià)值。
　　方法：建立分別感染5條、10條和20條雙性日本血吸蟲(chóng)尾蚴的哨鼠模型，將小鼠隨機(jī)平均分為兩組，一組用于剖解以評(píng)價(jià)實(shí)際感染程度，另一組分別在感染前（0d）和感染后3d、5d、1w和2w收集3組不同感染度小鼠血清，用兩種靶標(biāo)巢式PCR檢測(cè)血清DNA，同時(shí)設(shè)兩種免疫學(xué)方法對(duì)照。
　　結(jié)果: Sj19巢

6、式 PCR法對(duì)3組不同感染度小鼠在感染后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清DNA均可檢出陽(yáng)性結(jié)果；SjR2巢式PCR可檢出感染5條雙性尾蚴小鼠的感染后5d的血清 DNA，對(duì)感染10條雙性尾蚴小鼠的感染后3d、5d、1w的血清 DNA可檢出，對(duì)感染20條雙性尾蚴小鼠的感染后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清DNA均可檢出。而兩種免疫學(xué)方法（IHA和ELISA）對(duì)3組不同感染度小鼠的感染后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清均未檢出陽(yáng)性結(jié)果。
　　結(jié)論：Sj19和SjR2巢式PCR法對(duì)哨鼠

7、模型可在感染后3d或5d檢測(cè)出特異性DNA，顯示出較高的靈敏性。特別是Sj19巢式PCR法在感染5條雙性日本血吸蟲(chóng)尾蚴小鼠的感染后3d血清DNA中即可檢出陽(yáng)性 DNA，顯示出更高的靈敏性。本研結(jié)果表明，應(yīng)用Sj19和SjR2巢式PCR法檢測(cè)哨鼠模型血清DNA，大大縮短了預(yù)警時(shí)間，對(duì)日本血吸蟲(chóng)哨鼠早期預(yù)警具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　第三部分日本血吸蟲(chóng)尾蚴性別鑒定及配對(duì)感染后雌雄合抱率的研究
　　目的：評(píng)價(jià)PCR法鑒定日本血吸

8、蟲(chóng)尾蚴性別的效果，并探索不同感染度的雌雄尾蚴配對(duì)感染時(shí)，雌雄尾蚴易感性的差別，以及蟲(chóng)體存活和合抱率的變化。
　　方法：收集不同單只陽(yáng)性釘螺逸出的尾蚴，每只釘螺取兩個(gè)尾蚴樣本，堿裂解抽提尾蚴DNA，應(yīng)用序列特征化擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(SCAR-PCR)法鑒定單只釘螺逸出尾蚴的性別，將鑒定后的釘螺按雌、雄性別分開(kāi)飼養(yǎng)，約20天后再次逸出尾蚴，分別收集雌、雄尾蚴以5♂+5♀、10♂+10♀和15♂+15♀三個(gè)不同感染度配對(duì)感染小鼠，40d

9、后解剖，記錄每只小鼠檢獲蟲(chóng)體情況。
　　結(jié)果：共23只陽(yáng)性釘螺，經(jīng)鑒定，10只釘螺可逸出單雌性尾蚴，9只釘螺可逸出單雄性尾蚴，4只釘螺可逸出雙性尾蚴。
　　在配對(duì)感染中，感染5♂+5♀、10♂+10♀和15♂+15♀三組小鼠的雌、雄蟲(chóng)存活率分別為72.0％和82.0%、71.3%和85.0%、62.0%和72.7%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析雌、雄尾蚴易感性無(wú)顯著性差異；三組小鼠蟲(chóng)體總存活率分別為77.0%、78.0%、67.7%，其中感染