假單胞菌株M18藤黃綠菌素的生物合成基因簇、調(diào)控基因pltZ及其ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因簇的鑒定與功能研究.pdf

1、假單胞菌株(Pseudomonassp.)M18產(chǎn)生藤黃綠菌素(Pyoluteorin，Plt)與吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid，PCA)兩種不同類(lèi)型的抗生素，能抑制多種植物病原菌，是一株重要的生物防治菌株。本研究克隆、測(cè)序并鑒定了M18藤黃綠菌素生物合成基因簇及其下游序列共32.8kb的基因組區(qū)域，序列分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域共包含20個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，plt基因簇由位于其中22-kb基因組區(qū)域的10

2、個(gè)ORF組成：操縱子pltLABCDEFG、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因pltR、部分pltM基因，M18plt基因簇的基因組成、分布、大小與熒光假單胞菌Pf-5的基本相似。在plt基因簇下游8-kb基因組區(qū)域，首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個(gè)新的藤黃綠菌素生物合成負(fù)調(diào)控基因pltZ和一個(gè)新的涉及藤黃綠菌素免疫、促進(jìn)藤黃綠菌素合成與分泌的ABC(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運(yùn)基因簇pltHIJKNO，并預(yù)測(cè)提出了一個(gè)可能的藤黃綠菌素轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制模型。在p

3、ltZ和pltHIJKNO功能鑒定的基礎(chǔ)上，本課題還研究證實(shí)：pltZ轉(zhuǎn)錄阻抑ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)PltHIJKNO的表達(dá)，藤黃綠菌素能同時(shí)誘導(dǎo)自身生物合成基因和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)PltHIJKNO的表達(dá)。研究藤黃綠菌素生物合成的分子調(diào)控、轉(zhuǎn)運(yùn)分泌及自身免疫機(jī)制，對(duì)于通過(guò)基因工程提高抗生素產(chǎn)量及其生物防治能力、實(shí)現(xiàn)抗生素生產(chǎn)工業(yè)化具有十分重要的意義。 pltZ編編碼蛋白質(zhì)序列與其它TetR家族細(xì)菌調(diào)控蛋白具有廣泛的同源性，PltZ蛋白的第

4、19～65個(gè)氨基酸殘基間存在一個(gè)TetR家族調(diào)控蛋白的特征序列模體，其中第23～59個(gè)氨基酸殘基編碼一個(gè)HTH(helix-turn-helix)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。pltZ基因的突變引起藤黃綠菌素合成量比野生型提高4.4倍，而對(duì)吩嗪-1-羧酸的合成沒(méi)有影響。pltZ對(duì)藤黃綠菌素生物合成的負(fù)調(diào)控作用通過(guò)pltZ的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)與pltA'-'lacZ翻譯融合分析得到進(jìn)一步證實(shí)。 藤黃綠菌素ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因簇位于pltZ下游7.5kb基因

5、組區(qū)域內(nèi)，由pltH、I、J、K、N、O六個(gè)基因組成，作為一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄子，在pltZ相反方向轉(zhuǎn)錄，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示：這六個(gè)基因依次分別編碼一個(gè)膜融合蛋白PltH、一個(gè)Ⅱ型ATP結(jié)合蛋白PltI、兩個(gè)內(nèi)膜整合通透酶蛋白PltJ與PltK、一個(gè)外膜通道蛋白PltN及一個(gè)跨膜蛋白PltO，共同組成一個(gè)完整的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。Plt的生物合成需要該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)，pltH或pltI的突變菌株均未合成可探測(cè)水平的Plt，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

6、的過(guò)表達(dá)顯著提高M(jìn)18菌株合成Plt的能力。在大腸桿菌DH5α菌株中異源表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因簇不同基因或區(qū)域，測(cè)定該菌株對(duì)Plt的敏感性(最小抑制濃度)；在含有15μgmL-1和12.5μgmL-1Plt的LB培養(yǎng)基中，分別測(cè)定攜帶完整ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒pZX141的E.coliDH5α與空質(zhì)粒(pME6032)對(duì)照菌株的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)；兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：完整的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)負(fù)責(zé)對(duì)Plt的免疫或抗性。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)Plt生物合成的促進(jìn)功能

7、及其Plt抗性機(jī)制均可能由該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分泌與外排Plt的功能所介導(dǎo)，就此提出了一個(gè)可能的Plt轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制模型。 在野生型M18菌株和pltZ突變菌株M18Z中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因pltH'-‘lacZ翻譯、轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)的結(jié)果表明：pltZ轉(zhuǎn)錄阻抑PltABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)。pltZ有可能通過(guò)阻抑PltABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)，間接地負(fù)調(diào)控Plt的生物合成。 在添加或不添加外源Plt(終濃度10μgmL-1)的KMB培養(yǎng)基中，分