魚類幾種免疫相關(guān)基因的克隆與鑒定.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文魚類幾種免疫相關(guān)基因的克隆與鑒定姓名：金紅建申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：邵健忠2002.6.1浙江人學(xué)碩p 學(xué)’位論文A b s t r a c tAc D N A l i b r a r yo fg r a s sc a r p ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) l e u k o c y t e ss t i m u l a t e dw

2、 i t hv i r u sw a s c o n s t r u c t e di no r d e r t oc l o n ea n d a n a l y z e t h ei m m u n e g e n e sw h i c h a r ei n d u c e d a n de x p r e s s e db yv i r u s i n f e c t i o n i n t h ei m m u n es y s

3、 t e mo ft h i s f i s h ．I n i t i a l s t u d i e s o nr a p i di d e n t i f i c a t i o no ff i s h ’Sn e w g e n e sb ye x p r e s s e ds e q u e n c et a ga n a l y s i sw e r ea l s ou n d e r t o o ki nt h i s p

4、a p e r ．O u re f f o r t sw e r et a k e nt o l a yt h ef o u n d a t i o no ff u r t h e rs t u d i e so nc l o n i n ga n df u n c t i o no f n e w g e n e si nf i s h ．T h e c o n s t r u c t i o na n d e v a l u t i

5、 o no f t h e ? L g t l Oc D N A l i b r a r yo f g r a s sc a r pl e u k o c y t e sa r ed e s c r i b e d ．T o t a lR N A w a se x t r a c t e df r o m h e a d —k i d n e y l e u k o c y t e su s i n gS i n g l e —s t

6、e pm e t h o do fR N Ai s o l a t i o nb ya c i dg u a n i d i n i u mt h i o c y a n a t e —p h e n o l - c h l o r o f o r me x t r a c t i o n ．P o l y ( A ) m R N A w a s i s o l a t e dw i t hp a r a m a g e n t i c

7、 p a r t i c l e s m e t h o d ．T h e c D N A s w e r e s y n t h y s i z e d a f t e r a s e r i e s o fe n z y m e —c a t a l y z e dr e a c t i o na n d t h e nc l o n e di n t ok g t l Ov e c t o ra f t e rr e m o v

8、i n gs h o r ts e g m e n t sb ye D N A s i z e df r a c t i o n a t i o nc o l u m n s ．T h ee f f i c i e n c yo f p a c k a g i n gi sc o n f i r m e d t ob ea b o u t4 ．2 ×1 0 ’p f u ／u ga f t e ri n f e c t i n

9、 gt h eh o s tc 6 0 0 h f l ．T h el e n g t ho f i n s e a e de D N A r a n g e sf r o mO ．4 k bt O3 k b ．I td e m o s t r a t e d t h a tt h el i b r a r yi so f h i g hq u a l i t ya n d c a nb eu s e d a sa v a l u a

10、b l er e s o u r c e f o r s t u d y i n gg e n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t o r ym e c h a n i s m s ．M e a n w h i l e ，t h et a r g e tc D N A g e n e ss u c ha sg r a s sc a r pi n t e r f e r o n ( I F N )

11、 a n d N a t u r a lk i l l e rc e l le n c h a c e n m e n tf a c t o rf N K E F ) w a s p r o b e dw i t h P C R a m p l i f i c a t i o n ．T h r o u g hi n t e r g r a t e da n a l y s i so f p u b l i c ed a t a b a

12、s e s u c ha sE S T ，T I G RG e n eI n d e xi ns i l i c o ，u s i n gh u m a n i n m u n eg e n e ss e q u e n c e st h a ta r el i k e l yt ob ep r e s e n ti nf i s ha sq u e r y ，t w on e w f i s h ’Sg e n e sa s s o

13、s i a t e dw i t hi m m u n er e s p o n s ew e r ei d e n t i f i e d ，w h i c hi n c l u d i n gW i l m s ’t u m o r r e l a t e dg e n e ( Q M ) a n d N K E F ．T h e i r f u l l —l e n g t he D N A s e q u e n c e s w

14、 e r e a s s e m b l e d w i t hf i s h ’SE S T sf r o m p u b l i cE S T d a t a b a s e s ，a n dt h e na n a l y z e db ys o f t w a r e ss u c h a sO R F F i n d e r ,C l u s t a lW a n d G e n e D O C ．A c c o r d i

15、n g t Ot h ec o n s e r v e d d o m a i n s o f a l i g n e d N K E F g e n ea n d h u m N K E F g e n e ，a p a i r0 1 p r u n e r w a sd e s i g n e d ：N K E F s p e c i f i c f o r w a r d ( 5 1 C A T T G G A T TT C A

16、C C T T T G 3 ’) ，N K E Fs D e c i f i cr e ”e r s e ( 5 。T T C T C C G T G T T T G T C A G T 3 ‘) F o n yc y c l e so fa m p l i f i c a t i o n ( 9 4 bf o r3 0s e c o n d s ．5 5 ℃f o r3 0s e c o n d sa n d 7 2 “ G f o