幾種不同魚類肥胖基因的克隆與鯉肥胖基因的表達(dá)研究.pdf

1、自從人和小鼠的肥胖基因克隆后，肥胖基因一直成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)(leptin)是反映體內(nèi)脂肪含量的重要信號(hào)因子，leptin主要作用于下丘腦的特異受體，通過下丘腦進(jìn)行攝食調(diào)控和維持能量代謝的平衡，leptin還對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答，繁殖功能，神經(jīng)內(nèi)分泌等功能具有重要的作用，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)?，F(xiàn)在已經(jīng)克隆出了人、鼠、豬等動(dòng)物的肥胖基因，并對(duì)其生物功能和表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了深入的研究。而有關(guān)魚類的ob基因及其功能的研究很少見

2、相關(guān)報(bào)道。魚類品種繁多，不同品種的魚類具有不同的攝食習(xí)性，并且魚類體內(nèi)脂肪的含量、攝食量以及飽食感與其攝食習(xí)性均有較大程度的差異，而對(duì)魚類ob基因的研究將有利于闡明不同品種魚類的攝食習(xí)性與機(jī)體的脂肪含量、攝食量以及飽食感之間的關(guān)系，對(duì)研究魚類攝食調(diào)控的分子機(jī)理具有重要意義。本研究試圖克隆不同攝食習(xí)性魚類的ob基因，研究該基因在魚體內(nèi)和體外的表達(dá)特點(diǎn)，為研究魚類ob基因的功能奠定基礎(chǔ)。主要研究工作和結(jié)果如下：1.幾種不同魚類肥胖基因的克隆

3、提取不同攝食習(xí)性魚類腸系膜脂肪組織的RNA，包括雜食性魚類：鯉、鯽；草食性魚類：草魚、團(tuán)頭魴；濾食性魚類：鳙、鰱；肉食性魚類：青魚、烏鱧、大口鲇、鰻鱺、史氏鱘。利用RT-PCR技術(shù)從鯉腸系膜脂肪組織中擴(kuò)增出鯉肥胖基因的cDNA編碼序列，將其克隆至pMD18-T載體進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，幾種不同攝食習(xí)性魚類的ob基因編碼區(qū)均由438個(gè)核苷酸組成，編碼146個(gè)氨基酸，幾種不同魚類ob基因之間僅有2-4個(gè)核苷酸發(fā)生變異，導(dǎo)致1-2個(gè)氨基

4、酸發(fā)生改變。魚類ob基因的核苷酸和氨基酸的同源性均達(dá)到99％，與Genebank中ob基因序列的同源性進(jìn)行比較，ob基因具有很強(qiáng)的保守性，鯉ob基因與人、豬、小鼠核苷酸同源性分別為：84％、86％、95％，氨基酸的同源性分別為84％、82％、96％。 2.鯉不同組織和不同胚胎發(fā)育階段ob基因的表達(dá)提取鯉不同組織(心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肌肉、腦、脂肪)和不同發(fā)育階段胚胎(卵巢、桑椹期、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、肌肉效應(yīng)期、心跳期、出

5、苗前期、出苗期)的RNA，利用RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明，鯉ob基因在鯉不同組織中均有表達(dá)，在肝臟和脂肪組織中的表達(dá)量較高，在其他組織中也有一定的表達(dá)；鯉ob基因在未受精卵和不同的胚胎發(fā)育階段均有有表達(dá)。由于未進(jìn)行定量RT-PCR，本研究尚不能確定鯉ob基因在不同的胚胎發(fā)育中是否具有發(fā)育性變化。人和小鼠的ob基因主要在脂肪組織中表達(dá)，在胚胎中也有表達(dá)，本研究表明鯉ob基因的表達(dá)與人和小鼠相比具有較大的差異。 3.鯉o

6、b基因的表達(dá)節(jié)律及不同生理?xiàng)l件對(duì)ob基因表達(dá)的影響本研究由兩部分組成。試驗(yàn)Ⅰ：鯉ob基因在不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)，將40尾鯉按體重隨機(jī)分成4組，每組10尾，分別設(shè)置為正常對(duì)照組、饑餓組，飽食組和高脂肪組，14d后采集血清，分別測(cè)量血糖、膽固醇、甘油三酯、胰島素和leptin的濃度。結(jié)果表明，高脂肪組血糖濃度高于正常組(P＜0.05)、饑餓組(P＜0.01)和飽食組，饑餓組與正常組和飽食組具有明顯的差異(P＜0.01)；膽固醇在不同的試驗(yàn)組

7、中卻沒有明顯的差異；高脂肪組中甘油三酯的濃度高于其他組別，與正常組(P＜0.01)和饑餓組(P＜0.01)相比具有顯著差異，與飽食組差異不顯著，饑餓組甘油三酯的濃度明顯低于正常組和飽食組，并且差異極顯著(P＜0.01)；高脂肪組中胰島素的濃度均高于其他組別，并且差異極顯著(P＜0.01)，饑餓組胰島素濃度低于正常組，差異極顯著(P＜0.01)，飽食組與正常組之間沒有差異；高脂肪組中l(wèi)eptin濃度均高于其他組別，與正常組和饑餓組比較差異

8、極顯著(P＜0.01)，與飽食組差異顯著(P＜0.05)，饑餓組leptin濃度低于正常組和飽食組，差異極顯著(P＜0.01)，血清leptin濃度與鯉體重(rs=0.817，P＜0.01)、血糖濃度(rs=0.608，P＜0.01)、甘油三酯濃度(rs=0.521，P＜0.01)、胰島素濃度(rs=0.831，P＜0.01)濃度正相關(guān)。 試驗(yàn)Ⅱ：鯉ob基因的晝夜分泌表達(dá)規(guī)律，將192尾鯉分成2組，分別喂以基礎(chǔ)飼料和高脂肪飼料，

9、45天后采集血清，從上午10:00開始，24h之內(nèi)每隔2小時(shí)采集一次，每次8尾，分別測(cè)量不同時(shí)間鯉ob基因的leptin濃度。結(jié)果顯示，高脂肪組中鯉血清leptin的濃度明顯高于正常組中鯉血清leptin的濃度(P＜0.01)。兩組的晝夜節(jié)律的低谷均出現(xiàn)在中午12:00左右，高峰出現(xiàn)在午夜至4：00左右，正常組和肥胖組晝夜變化幅度分別為73.5％和33.1％。表明正常組和高脂肪組鯉ob基因均出現(xiàn)一定的晝夜分泌表達(dá)規(guī)律。 4.鯉o

10、b基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)及生物學(xué)活性分析將鯉ob基因克隆至融合性原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了鯉ob基因表達(dá)載體pET-28a-ob，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行提取和純化，SDS-PAGE檢測(cè)表明，鯉ob基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)，經(jīng)凝膠掃描分析，目的蛋白占總蛋白的40％以上。產(chǎn)物的分子量約為20KD，Westernblot分析表明，融合蛋白具有較好的免疫學(xué)活性。建立了小鼠肥胖模型。將40只昆明小鼠隨

11、機(jī)分成兩組，分別喂以基礎(chǔ)飼料和高脂飼料，45天后分為4組，設(shè)為正常對(duì)照組、正常注射組、肥胖對(duì)照組和肥胖注射組，每組10只，正常注射組和肥胖注射組注射10ug/kg的重組蛋白，對(duì)照組注射10ug/kgPBS。記錄攝食量和體重變化，7d后采集血清，測(cè)量血清中血糖、膽固醇、胰島素和甘油三酯的濃度。結(jié)果表明，重組鯉leptin能夠降低正常小鼠和肥胖小鼠的攝食量和體重和體脂量，能夠降低肥胖小鼠的血糖、膽固醇、胰島素和甘油三酯的濃度，能夠減少肥胖小

12、鼠的leptin抵抗現(xiàn)象，并且小鼠體脂的含量與血糖(rs=0.46，P＜0.05)、膽固醇(rs=0.78，P＜0.01)、甘油三酯(rs=0.767，P＜0.01)、胰島素(rs=0.62，P＜0.01)具有明顯的正相關(guān)性。 5.鯉ob基因在畢赤酵母中的表達(dá)將鯉ob基因克隆至含有AOXl啟動(dòng)子和a-factor信號(hào)序列的酵母表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPIC9K-ob，經(jīng)過PCR和酶切鑒定正確后，用SalⅠ線性