美洲商陸抗病毒蛋白Ⅰ的基因克隆和表達及其生物學(xué)活性分析.pdf

1、目的：美洲商陸抗病毒蛋白Ⅰ(Pokeweedantiviralprotein，PAPⅠ)是核糖體失活蛋白的一種，分子量29kDa，它能夠攻擊真核細胞28S和原核細胞23S核糖體RNA，并且從核糖體RNA保守的S/R區(qū)移去特異的一個腺嘌呤堿基而使EF2延伸因子無法正常行使功能，蛋白合成受到抑制。類似于其他的核糖體失活蛋白，美洲商陸抗病毒蛋白有很強的細胞毒性，能夠誘導(dǎo)細胞凋亡和死亡。PAP能夠抑制HIV-1病毒的復(fù)制已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多年，最近，Au

2、等發(fā)現(xiàn)Luffin-a等核糖體失活蛋白能夠強烈抑制HIV-1病毒的整合，可能有臨床應(yīng)用前景。本研究旨在利用基因工程方法克隆美洲商陸抗病毒蛋白Ⅰ的基因，構(gòu)建其表達載體，并獲得有活性蛋白，并研究美洲商陸抗病毒蛋白的生物學(xué)活性以及與HIV-1長末端重復(fù)序列(LTR)的相互作用。 方法：根據(jù)報道的cDNA序列，設(shè)計合成兩條引物，在兩條引物上分別添加NdeⅠ酶切位點，TGA終止密碼子和HindⅢ酶切位點，用RT-PCR的方法從美洲商陸春葉

3、中克隆PAPⅠ基因，與pMD18-TSimpleVector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，挑取白色單克隆菌落擴增，少量抽提質(zhì)粒，NdeⅠ和HindⅠⅡ雙酶切鑒定。對確實含有外源片段的陽性亞克隆測序，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ對測序結(jié)果滿意的亞克隆產(chǎn)物進行雙酶切，目的基因片段切膠回收，與經(jīng)相同酶切的pET44a-c(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂LB平板，挑取轉(zhuǎn)化成功單克隆菌落擴增，少量抽提質(zhì)粒，雙

4、酶切、小量表達鑒定重組質(zhì)粒。將含有正確表達載體pET-44a(+)-PAPⅠ的轉(zhuǎn)化菌BL21(DE3)IPTG誘導(dǎo)表達，收集菌體沉淀，將沉淀超聲破菌，將超聲所得沉淀反復(fù)洗滌，尿素溶解包含體，透析復(fù)性。復(fù)性蛋白溶液用Blue-Sepharose6B親和層析純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，用MTT法檢測細胞毒性。用統(tǒng)計學(xué)方法比較PAPⅠ組和RTA組(對照組)細胞存活率的差異。瓊脂糖凝膠電泳檢測蛋白的DNA酶作用，ELISA方法驗證其與LT

5、R的相互作用，分子模擬的方法建立美洲商陸抗病毒蛋白與LTR作用的模型。 結(jié)果：PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳，溴乙錠染色后，在紫外光下可見一條明顯的約800bp的亮帶，與預(yù)計的目的片段長度大小一致。目的片段與T載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，長出白色克隆，抽提質(zhì)粒用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切確認外源片段插入，經(jīng)測序證實該片段序列與所報道的PAPⅠ核苷酸序列基本一致。重組質(zhì)粒pET-44a(+)-PAPⅠ用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切

6、，1％瓊脂糖凝膠電泳。可見大小約5500bp和800bp的兩個片段，說明PAPⅠ的編碼基因已插入pET-44a-c(+)。含重組子pET-44a(+)-PAPⅠ的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，菌液及菌體超聲破菌后沉淀和上清12％SDS-PAGE電泳，經(jīng)誘導(dǎo)菌液泳道及超聲沉淀泳道均可見一分子量約為29kD的蛋白條帶，與PAPⅠ的分子量吻合，而未誘導(dǎo)菌液與超聲上清無相應(yīng)條帶，這說明PAPⅠ以包含體形式正確表達。包含體反復(fù)洗滌后純度達7

7、0％以上，尿素溶解，透析復(fù)性所得產(chǎn)物純度約30％，復(fù)性率較低。復(fù)性液經(jīng)Blue-Sepharose6B純化，SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示其純度大于90％。MTT法進行毒性檢測，表明復(fù)性純化后的PAPⅠ具有與蓖麻毒素A鏈(RTA)相似的細胞毒性。純化的美洲商陸抗病毒蛋白Ⅰ對癌細胞有明顯的殺傷作用，能夠作用與超螺旋DNA具有核酸內(nèi)切活性，與LTR能夠相互作用。 結(jié)論：本實驗采用RT-PCR的方法，從美洲商陸春葉中克隆得到了正確的P

8、APⅠ基因，并將其插入到載體質(zhì)粒pET-44a(+)中，成功構(gòu)建了PAPⅠ的表達質(zhì)粒pET-44a(+)-PAPⅠ。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)在IPTG誘導(dǎo)下，表達出分子量約為29kD的蛋白質(zhì)，與目的蛋白分子量一致。而蛋白質(zhì)電泳表明目的蛋白主要以包含體形式表達，所得包含體經(jīng)反復(fù)洗滌后純度可達70％以上。洗滌后的包含體經(jīng)尿素溶解，透析復(fù)性，可得到少量的復(fù)性蛋白，純度在30％左右。復(fù)性液經(jīng)Blue-Sepharose6B親和純